李栋，张康，马晓芸，袁维秀，刘晓燕

（1.中国人民解放军总医院 麻醉手术中心，北京 100853；2.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850）

真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a的构建及功能验证*

李栋1，张康2，马晓芸2，袁维秀1，刘晓燕2

（1.中国人民解放军总医院 麻醉手术中心，北京 100853；2.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850）

目的 构建含大鼠ASIC2a全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）的绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFPN1-ASIC2a并转染至HEK293细胞，观察其表达和分布情况。方法 设计、合成ASIC2a基因引物，利用聚合酶链反应（PCR）技术，以现有质粒pcDNA3.1-ASIC2a为模板扩增出含有限制性内切酶（XhoⅠ与EcoRⅠ）酶切位点的ASIC2a基因片段与载体pEGFP-N1酶切后连接形成重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a，并瞬时转染至HEK293细胞中，利用细胞膜片钳方法观察其表达电流的情况。为进一步明确其亚细胞定位，将质粒EGFPN1-ASIC2a、pDsRed-Monomer-Mem和pDsRed2-ER共同转染至HEK293细胞中。结果 PCR扩增得到正确的ASIC2a基因片段，酶切鉴定和测序证实获得重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a，并将其瞬转至HEK293细胞后，成功记录到ASIC2a同聚体电流。然后利用共转染的方法观察到，pEGFP-N1-ASIC2a主要在HEK293细胞内质网表达，细胞膜表达较少。结论 重组绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a构建成功，且在HEK293细胞中主要表达于内质网，为下一步研究ASIC2a的功能，特别是为ASIC2a在缺血性神经元损伤中的作用及其机制的研究奠定基础。

ASIC2a；载体构建；真核表达载体；绿色荧光蛋白

酸感受离子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）属于上皮钠通道/退变素超家族中的一员，是一类质子（H+）激活对阳离子选择性通透的非电压依赖的配体门控性离子通道。目前，已经克隆出6种ASIC 的 亚 基 ：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。……