张丽丽+王兰英+唐萌+杨海茹+胡玲+蔡佳旋+黄艳怡

摘要：采用RAPD分析了5个不同产地的花脸香蘑（Lepista sordida）菌丝体和子实体的DNA多样性。用12种引物分别对5种样品进行PCR扩增，从中选出8种引物扩增后的结果进行数据分析，计算样品间的遗传相似系數（GS值），进而根据遗传相似系数矩阵，利用UPGMA法进行聚类分析。结果表明，花脸香蘑菌丝体和子实体分为两个类群，又将3个不同产地的菌丝体分为2个亚群，为花脸香蘑后期研究提供参考。

关键词：花脸香蘑（Lepista sordida）；DNA多样性；聚类分析

中图分类号：S646 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2758-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.041

Abstract： Using RAPD analysis of the five different regions of mycelia and fruiting body of Lepista sordida DNA diversity. Respectively with 12 primers for PCR amplification， five samples selected by 8 primers' amplification result for data analysis， the genetic similarity coefficient between the sample value（GS），and then according to the genetic similarity coefficient matrix， the cluster analysis using UPGMA method. The results showed that RAPD mycelia and fruiting body Lepista sordida method is divided into two groups， and the mycelium of three different regions can be divided into two subsets， it can be seen that the genetic relationship provide reference for later study of Lepista sordida.

Key words： Lepista sordida； DNA diversity； clustering analysis

花脸香蘑（Lepista sordida）又名紫香花脸蘑，隶属于伞菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）香蘑属（Lepista）[1]，花脸香蘑的子实体营养丰富，风味独特，是一种具有较高开发价值的食用菌[2]。但人工栽培的花脸香蘑存在子实体易碎、不易运输等缺陷，有待于通过杂交等育种方式进行改良，这就需要对花脸香蘑种质资源进行广泛采集和科学鉴定，以避免因形态相似或分离失误而出现偏差[3]。

本研究利用RAPD技术，鉴定花脸香蘑菌株，克服传统的标记手段和形态分类学的缺点，为花脸香蘑的深入研究提供了强有力的工具和手段，其应用和发展前景广阔。

1 材料与方法

1.1 材料

花脸香蘑1号菌种购于苏州北纳创联生物技术有限公司，编号为BNCC117075，采集地为山东；花脸香蘑2号菌种购于苏州北纳创联生物技术有限公司，编号为BNCC110924，采集地为黑龙江；花脸香蘑3号菌种由吉林大学珠海学院化学与药学系实验中心提供；花脸香蘑4号子实体产地为内蒙古大兴安岭阿尔山林区；花脸香蘑5号子实体产地为吉林长白山地区，以上5种菌类原始样品，样品编号1～5。

1.2 基因组DNA的提取

采用CTAB法提取样品基因组DNA，具体步骤参考Zhang等[4]方法进行。

1.3 RAPD分析

1.3.1 RAPD反应体系和扩增条件 PCR扩增体系（20 μL）为DNA模板2 μL、Primer 1 μL、DNA Mix 10 μL、去离子水7 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，36 ℃退出50 s，72 ℃延伸1.5 min，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[5]。

1.3.2 RAPD扩增产物的检测 利用表1中的12种引物对5个样品进行PCR扩增，PCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶电泳中检测。

1.4 数据统计分析

PCR扩增产物电泳位置在凝胶某个相同迁移率位置上有DNA条带记为1，无DNA条带记为0，如表2所示，形成RAPD的表型数据矩阵，可以将PCR扩增的结果数字化，便于后续的分析。NTSYS软件计算相似系数（DICE系数），并且按照遗传距离进行UPGMA聚类分析[6]。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

用CTAB方法提取5种样本的基因组DNA，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，发现所得的DNA主条带清晰，没有出现明显的拖尾显现（图1）。说明提取的DNA保持良好的完整性，花脸香蘑菌丝体及子实体中的多糖等去除的效果良好[7]，可以进行下一步RAPD检测。

2.2 RAPD分析结果

利用RAPD分子标记技术对5个样品进行遗传多样性分析，12条引物扩增如图2所示。从图2中可以看出，选出8种条带清晰的引物进行数据分析，选择的引物代码为P2、P3、P5、P7、P8、P10、P11、P12。

2.3 8种引物及其扩增的多态性条带数

8种引物在5种样品中共获得46个扩增条带，其中多态性条带有39个，扩增出的多态性条带百分率为84.78%，说明供试的5种样品具有丰富的遗传多态性，对不同的生存环境表现出较强的适应能力，符合花脸香蘑广泛分布的特点。P7引物扩增出的多态性条带数最多（7条），而P3引物扩增出的多态性条带数最少（2条）。不同引物扩增出的清晰条带数在4～8之间，平均每个引物扩增出的条带数为5.75条，多态性条带数为4.88条，多态性条带百分率为82.90%[8]，表3列出了8种引物对5种样品扩增的多态性条带数。

2.4 供试材料的亲缘关系分析

利用8种引物在5种样品中获得46个扩增片段，如表3所示。在NTSYS软件中计算样品间的遗传相似系数（GS值），得到供试材料遗传相似矩阵。遗传相似系数越大，表明亲缘关系越近，遗传相似系数越小，表明亲缘关系越远[9]。由表4可知，5种样品的GS值范围为0.282 6～0.913 0，变幅为0.630 4。其中4号样品和5号样品之间的遗传相似系数最大为0.913 0，表明这两个样品之间的亲缘关系较近，遗传差异性小。3号样品和4、5号样品之间的遗传相似系数最小为0.282 6，表明3号样品与4、5号样品之间的亲缘关系较远，遗传差异性较大，存在较高的遗传多样性。

2.5 RAPD分子标记聚类分析

根据遗传相似系数矩阵，利用UPGMA法进行聚类分析，根据遗传相似系数对各样品进行分类分析，聚类图如2所示。5种样品分成2类，样品1、2、3是第一类，样品4、5是第二类。其中第一类又分为2个亚类，第一亚类为1号样品，样品2、3号为第2亚类[10]。

3 结论与讨论

4号样品和5号样品之间的亲缘关系较近，遗传差异性小。3号样品与4、5号样品之间的亲缘关系较远，遗传差异性较大，存在较高的遗传多样性。 5种样品分成2个类群，样品1、2、3是第一类群，样品4、5是第二类群。可见，RAPD将花脸香蘑菌丝体和子实体分为2个类群，2号和3号菌丝体亲缘关系比与1号菌丝体亲缘关系近。花脸香蘑遗传多样性，是由于自身遗传体系与产地复杂变化的自然生态环境长期共同作用的结果，为花脸香蘑后期开发提供一定的参考。

参考文献：

[1] 卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州：河南科技技术出版杜，2000.

[2] 郭 勇，彭卫红，贾定洪.花脸香蘑的栽培技术[J].食用菌，2007（3）：41-42.

[3] 戴彩云，崔晓明.茶园自生食用菌紫丁香蘑的馴化栽培[J].贵州茶叶，1994（1）：24.

[4] ZHANG Y F，MOLINA F I. Strain typing of Lentinula edodes by random amplified polymorphic DNA assay[J].Fems Microbiology Letters，1995，131（1）：17-20.

[5] WELSH J，HONEYCUTT R J，MCCLELLAND M，et al. Parentagede termination in maize hybirds using the arbitrarily primed polymerase chain reaction（AP-PCR）[J]. Theoretical & Applied Genetics，1991，82（4）：473-476.

[6] 孙 勇，林芳灿.中国香菇自然种质遗传多样性的RAPD分析[J].菌物系统，2003，22（3）：387-393.

[7] 汤 洁.不同种绞股蓝的RAPD分析及其抑菌作用的研究[D].合肥：安徽农业大学，2008.

[8] 林 媛.双孢蘑菇品种间RAPD遗传多样性与亲缘关系的研究[D].福州：福建农林大学，2008.

[9] 张金霞，黄晨阳，张瑞颖等.中国栽培白灵侧耳的RAPD和IGS分析[J].菌物学报，2004，23（4）：514-519.

[10] 谭 琦.用RAPD技术对香菇非对称杂交后代遗传性状的分析[J].食用菌学报，2001，8（2）：10-14.