李宛静，徐晓娟△，黄映红，邓蒂斯，雒芙蓉，张 纯

(1.成都中医药大学临床医学院，成都 610075；2.成都中医药大学临床医学院，成都 610075)

【实验研究】

补肾化痰方调控大鼠卵巢GC中APN信号通路机制的研究

李宛静1，徐晓娟1△，黄映红2，邓蒂斯1，雒芙蓉1，张 纯1

(1.成都中医药大学临床医学院，成都 610075；2.成都中医药大学临床医学院，成都 610075)

目的：通过分析补肾化痰方对大鼠颗粒细胞脂联素受体1/2(AdipoR1/2)蛋白表达水平及下游分子相关基因表达的差异，探讨该复方激活卵巢GC中APN信号通路的机制。方法：采用雌性SD大鼠，体外培养卵巢颗粒细胞，Western-blotting测定AdipoR1/2的蛋白表达量，Real-time PCR测定AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a的mRNA表达。结果：与空白组比较，罗格列酮组、中药中低剂量组大鼠GC的AdipoR1/2含量均明显上升且差异有统计学意义；GC中AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a的mRNA表达量亦有明显的变化趋势，与空白组比较，罗格列酮组、中药中低剂量组的mRNA表达差异有统计学意义。结论：补肾化痰方能激活大鼠GC中APN信号通路的机制，可能与该方调节卵巢生殖激素转化及卵巢局部糖脂代谢相关。

补肾化痰方；卵巢颗粒细胞；APN信号通路

补肾化痰方在中医妇科临床治疗多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)、卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)、不孕症(Infertility)等疾病中已经取得显著疗效，然其具体机制尚不明确。近年研究发现，卵巢颗粒细胞(granulosa cell, GC)在诸多妇科疑难病种的发病机制中扮演着重要角色，能影响排卵、黄体生成、女性甾体激素水平及卵巢局部的糖脂代谢水平[1]。本文采用该复方干预体外培养卵巢颗粒细胞，旨在阐明该方通过激活卵巢GC中APN信号通路，发挥调节卵巢生殖激素转化及卵巢局部糖脂代谢的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用3～4周龄清洁级雌性SD大鼠，体质量约60～70 g，由成都中医药大学动物实验中心提供(动物许可证号SCXK(川)2013-24)。

1.2 实验用药物及主要试剂

补肾化痰方组成：菟丝子30 g，覆盆子30 g，桑椹子30 g，补骨脂10 g，鹿角霜10 g，紫河车10 g，茯苓20 g，陈皮15 g，车前子15 g，肉苁蓉15 g等，由成都中医药大学民族医药学院实验室统一制备成14.8 g/ml、7.4 g/ml、3.7 g/ml的水煎液，分别相当于成人用药等效剂量10、5、2.5倍。罗格列酮(太极集团重庆涪陵制药厂有限公司生产，批号15020009)，FSHR第一抗体(武汉博士德生物工程有限公司，多克隆兔抗鼠，生产批号AD082527)；AdipoR1第一抗体(Santa Cruz Company，多克隆抗体，羊抗鼠)；孕马血清(PMSG,Solarbio，生产批号20141117)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司)；TRIZOL试剂液(Invitrogen Company)；反转录试剂盒(BIO-RAD；iScriptTMcDNA Synthesis Kit)；荧光定量PCR 所用试剂盒(BIO-RAD；SsoFastTMEvaGreen®Superemix)。

1.3 补肾化痰方含药血清的制备

取6～7周龄的SD雌鼠50只，体质量约180～200 g，随机分为中药高、中、低剂量组、罗格列酮组、空白组各10只。中药高、中、低剂量组分别给予7.4 g/100 g、3.7 g/100 g、1.85 g/100 g的补肾化痰方水煎液，罗格列酮组按成人剂量的10倍给予罗格列酮0.08 mg/100 g，空白组大鼠给予等体积生理盐水。各组均灌胃2次/d，连续3 d后禁食12 h，于第4天一次性给予全天剂量，1 h后股动脉取血。将各组血液于4℃下静置4 h，2000 r/min离心15 min，取上清抽滤除菌同组混匀，56℃条件下灭活30 min并分装，-20℃保存备用。

1.4 大鼠GC的分离、培养及鉴定

参照Lovekamp[4]等方法，取雌性SD大鼠30只，皮下注射PMSG 40 IU，48 h 后分离GC，将GC加入含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养液中制备单细胞悬液，按3×105个/ml接种于24孔板，并将细胞分为空白血清组、中药高、中、低剂量组、罗格列酮组，每组10孔，37℃、5% CO2培养箱中预培养3 d后弃培养液，加入含空白血清或含药血清的DMEM继续培养48 h,处理方法如下。

空白组每孔加入含20%空白血清的DMEM培养液1 ml； 中药高剂量组每孔加入含20%高剂量补肾化痰方血清的DMEM培养液1 ml； 中药中剂量组每孔加入含20%中剂量补肾化痰方血清的DMEM培养液1 ml； 中药低剂量组每孔加入含20%低剂量补肾化痰方血清的DMEM培养液1 ml； 罗格列酮组每孔加入含20%罗格列酮血清的DMEM培养液1 ml。

GC的鉴定：将GC以2×106/ml 的密度接种于已预置好小盖玻片的6孔培养板中，37℃、5% CO2及完全饱和湿度条件下培养制成细胞爬片。当细胞生长至70%融合时取出玻片，行细胞免疫化学染色。

1.5 Western Blotting检测GC的AdipoR1/2表达

提取各组GC的总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度，Western blotting检测 GC 的AdipoR1表达水平，一抗1∶200稀释，二抗1∶1000稀释。扫描PVDF膜上各条带，记录各条带的平均光密度值，用以表示GC细胞膜AdipoR的相对含量，比较各组GC细胞膜AdipoR1表达的差异。

1.6 Realtime PCR检测GC中AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19amRNA的表达

表1显示，使用Invitrogen TRIZOL试剂提取细胞总RNA，用1%非变性琼脂糖凝胶电泳，然后用紫外凝胶成像系统观察RNA的完整性。所得RNA采用BIO-RAD公司的iScriptTMcDNA Synthesis Kit进行反转录为cDNA，设计引物后对PCR进行扩增。荧光定量PCR 所用试剂盒为BIO-RAD 公司的SsoFastTMEvaGreen ©Superemix，PCR反应在Bio-Rad IQ5 PCR仪上进行，每个样品均重复3次以避免加样误差，实验数据利用iQ5-Cycler进行分析，分析方法为ΔΔCt法。根据NCBI公布的基因序列进行引物设计。

表1 检测基因的引物序列表

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠卵巢组织中卵泡GC鉴定

图1显示，采用免疫组织化学染色法对取材正确性进行鉴定，结果显示所培养的细胞为大鼠卵巢组织中卵泡颗粒细胞。

图1 大鼠卵巢组织中卵泡颗粒细胞免疫化学染色结果(100×)注：GC取材于大鼠卵巢组织中的卵泡，箭头标示处为卵巢颗粒细胞

2.2 补肾化痰方对GC的AdipoR1/2表达的影响

图2 大鼠卵巢组织中卵泡颗粒细胞AdipoR1、AdipoR2蛋白的Western blotting检测电泳条带注：Western blotting法检测采用双盲法，每个蛋白组别顺序不同。K.空白血清组；D.中药低剂量组；G.中药高剂量组；L.罗格列酮组；Z.中药中剂量组

图2表3显示，本研究采用Western blotting观察补肾化痰方调控GC细胞膜上AdipoR1、AdipoR2的表达水平，各组细胞的总蛋白质浓度分别为空白血清组2.52 mg/ml，中药中剂量组2.53 mg/ml，中药低剂量组2.14 mg/ml，中药中剂量组2.48 mg/ml，罗格列酮组3.12 mg/ml。结果显示，GC细胞膜表面均存在AdipoR1、AdipoR2的特异性表达；与空白血清组比较，中药低剂量组、中剂量组和罗格列酮组的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，其中中药中剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。

组 别样品孔AdipoR1表达量AdipoR2表达量空白组31.02±0.011.07±0.12罗格列酮组33.65±0.07*4.44±0.09*中药低剂量组310.62±0.10**3.88±0.06*中药中剂量组314.05±0.15**5.23±0.09**中药高剂量组32.58±0.17*3.33±0.11*

注：与空白组比较:*P<0.05，**P<0.01

2.3 补肾化痰方对GC的AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a表达的影响

表3显示，本研究采用Realtime-PCR法测定卵巢颗粒细胞AMPK、Cyp19a、PPAR-α/β/γ的表达有明显的变化趋势。与空白组比较，罗格列酮组及中药中、低剂量组的表达量均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。

组 别例数AMPKPPAR-αPPAR-βPPAR-γCyp19a空白组32.00±0.113.06±0.241.52±0.274.03±0.272.07±0.24罗格列酮组34.00±0.45*7.47±0.20*4.58±0.41*9.93±0.44**4.97±0.41*中药低剂量组34.19±0.17*6.29±0.26*3.01±0.18*7.97±0.28*4.43±0.24*中药中剂量组35.04±0.41**8.95±0.48**5.27±0.22**9.22±0.26**6.05±0.23**中药高剂量组33.77±1.06*5.38±0.26*2.69±0.21*4.86±0.244.02±0.25*

注：与空白组比较：*P<0.05；**P<0.01

3 讨论

本实验基于中医理论及导师徐晓娟教授长期临床实践，选用补肾经典复方五子衍宗丸及痰湿证常用方苍附导痰汤临证加减，去五味子选用更精于补益精血的桑椹子。全方补肾阳益精血、补中寓行、燥湿健脾、行气解郁化痰，两方合用共奏补肾健脾化痰、调理冲任之功。现代药理学研究显示，补肾化痰类中药具有类雌激素样作用，可作用于下丘脑调节促性腺激素分泌[2]，促进颗粒细胞增殖[3]，增加卵泡对卵泡刺激素的反应性，引起下丘脑-垂体反馈，促进初级卵泡向优势卵泡发育，减少痰湿体质患者体内脂肪积聚，改善血中载脂蛋白含量和血液的浓黏凝聚状态。临床及实验研究均证实[4]，补肾化痰复方可以调节患者体内雌激素和雄激素水平而促排卵，并能改善糖脂代谢功能。

已有研究证实[5]，猪卵巢中脂联素与雌激素的合成有关。有研究已证实，GC通过影响促性腺激素对卵母细胞进行调节，能构建有利于卵母细胞发育成熟的分子微环境[6]。因此，APN/AMPK信号通路的激活，能够正向调节卵巢GC生殖激素的转化，并促进卵泡的发育。有研究证实，CYP19a基因是编码雌激素生成的关键酶——细胞色素P450芳香化酶，是雌激素合成最后一步的限速酶，其表达与雌激素生成相关[7]。据此推测此为该方改善PCOS、卵巢早衰、不孕症等疾病的机制。有研究证实[8-9]，该条通路的激活能够促进脂肪酸的燃烧与能量的消耗；而PPAR-γ是与肥胖、胰岛素抵抗密切相关的基因，其激动剂罗格利酮已经广泛应用于临床治疗2型糖尿病及PCOS伴发胰岛素抵抗的患者。有研究表明，脂联素及其mRNA表达在肥胖者表达量下降，而其表达水平随体质量减轻又再次增加[10]。亦有研究显示，血清及卵泡液脂联素含量与BMI呈负相关；在肥胖型PCOS痰湿证中，血清及卵泡液的APN水平及AdipoR1/2表达水平均显著性下降。

根据本实验结果提示，补肾化痰方能活化AdipoR1/2，上调CYP19a的表达，促进雄烯二酮向雌激素转化，而机体维持正常的雌激素水平是卵泡发育及子宫内膜发育的必备条件，因此该法能够有效改善卵泡发育障碍，而临床能够有效治疗PCOS、POF、Infertility等疾病，其机制可能与此有关。另外根据实验结果提示，该方能活化AdipoR，并能上调PPARα/β/γ的表达，改善因女性生殖内分泌紊乱引起的卵巢局部糖脂代谢紊乱，为卵母细胞发育为优势卵泡提供良好的分子微环境。

综上所述，本项研究结果与课题组整体实验采用肥胖型PCOS大鼠观察补肾化痰方对GC中APN信号通路的影响及其对糖代谢、卵泡发育的调控作用一致，故可推测补肾化痰方能通过调控APN/AMPK信号通路传导正向调节卵巢激素转化及卵巢糖脂代谢。

[1] HULAS-STASIAK M, GAWRON.Follicular atresia in the prepubertal spiny mouse(Acomys cahirinus)ovary[J].Apoptosis,2011,16(10):967-975.

[2] 夏天，韩冰.补肾调冲方含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖、激素分泌和mRNA表达的影响[J].现代药物与临床，2011，26(5):384-388.

[3] 蔡竞，吴克明，熊婷婷，等.补肾活血法促进卵泡发育障碍模型大鼠卵巢颗粒细胞增殖的实验研究[J].北京中医药大学学报，2014，37(4):231-235.

[4] 林寒梅，贺恒祯，马平兰.补肾化痰法对多囊卵巢综合征患者胰岛素抵抗的影响[J].黑龙江中医药杂志，2013，3：50-52.

[5] 邵康，周杰，吴小雪，等.猪卵巢中脂联素受体与FSHR和CYP19基因表达的发育变化及其相关性研究[J].南京农业大学学报，2013，36(4):141-144.

[6] REGASSA A, RINGS F, HOELKER M, et al, Transcriptome dynamics and molecular cross-talk between bovine oocyte and its companion cumulus cells[J].BMC Genomics, 2011,12: 57.

[7] CZAJKA-ORANIECI,SIMPSON ER. Aromatase research and its clinical significance[J].Endokrynol Pol, 2010,61(1):126-134.

[8] 白曼，赵佳，展微，等.脂联素及其受体的研究进展及在生殖中的作用[J].中国畜牧兽医，2015，42(7)：1830-1835.

[9] 胡卫红，陈琳，同军，等，PPARγmRNA在卵巢颗粒细胞的表达调节及与多囊卵巢综合症的相关性[J].北京大学学报：医学版，2013，45(6):859-863.

[10] SEPILIAN V, NAGAMANI M.Adiponectin levels in women with polycystic ovary syndrome and severe insulin resistance[J].J Soy Gynecol Investing, 2005, 12:129-134.

Study on the Mechanism of APN Signaling Pathway Regulating GC in Ovary of Rats by Tonifying Kidney and Resolving Phlegm Prescription

LI Wan-jing1, XU Xiao-juan1△, HUANG Ying-hong2, Deng Di-si1, LUO Fu-rong1, ZHANG Chun1

(1.ClinicalmedicineschoolofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075，China; 2.BasicmedcineschoolofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

Objective: By analyzing the protein expression levels of adiponectin receptor1/2(AdipoR1/2) and the gene expression differences related downstream molecules, in order to explore the mechanism of activation the APN signal pathway in rat ovarian granulosa cells(GC) by the Tonifying Kidney and Resolving Phlegm(TKRP) method.Methods: Selected female SD rats, cultured rat ovarian GC in vitro, measured the protein levels of AdipoR1/2 by Western-blotting and the mRNA expression of AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a by Real-time PCR. Results: Compared with the control group,AdipoR1/2 expression of rosiglitazone and middle、low dose group of the TKRP has up to a higher level, which has statistical significance;the mRNA expression of AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a in middle、low dose group of the TKRP was also significantly higher than the control group.Conclusion: The TKRP can activate the APN signal pathway in rat ovarian GC, it may be associated with the TKRP regulating reproductive hormone conversion and glycolipid metabolism in ovary.

Tonifying Kidney and Resolving Phlegm Recipe; Ovarian granulosa cells; APN signal pathway

国家自然科学基金资助项目(81470199)-经APN信号通路探讨补肾化痰法调控肥胖型PCOS卵泡发育机制研究；四川省教育厅基础项目研究(142A0315)-以APN信号途径为靶点研究补肾化痰法调控肥胖型PCOS雌鼠GC增殖分化机制

李宛静(1990-)，女，四川华蓥人，医学硕士，从事中西医对肥胖多囊卵巢综合征发病机制研究。

△通讯作者：徐晓娟(1969-)，女，江苏镇江人，副研究员，医学博士，硕士研究生导师，从事补肾中药对女性生殖内分泌调控研究，Tel：13980971928，E-mail: 847956379@qq.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)05-0642-03

2016-11-09