李玲玉 方 健 于 淼 陈天圣

(华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070)

青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

李玲玉 方 健 于 淼 陈天圣

(华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070)

青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类, 为探究prdm14同源基因的潜在作用, 实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先, 将prdm14基因的部分编码区连接到pET32a质粒中, 构建重组表达载体pET32a-prdm14∆600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达, 获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后获得阳性抗体, 最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下, 可获得Prdm14重组蛋白的高效表达; 制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。综上所述, 研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体, 该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。

青鳉; Prdm14; 原核表达; 多克隆抗体; 干细胞

细胞的多能性调控和分化的分子机制是干细胞生物学领域的一个重要问题。研究表明PRDM家族成员参与了细胞早期的分化, 它们能通过组蛋白酶的激活或者相互作用来调控目的基因的表达, 从而参与转录调节和染色体的表观修饰过程[1,2]。作为PRDM家族中重要的一员, PRDM14包含一个PR/SET结构域和6个锌指结构。……