蒋秀燕，王丛丛

(中国石油大学胜利学院化学工程学院，山东东营 257061)



CE法分离检测对羟基苯丙酮酸互变异构体

蒋秀燕，王丛丛

(中国石油大学胜利学院化学工程学院，山东东营 257061)

采用毛细管电泳-安培检测法测定了对羟基苯丙酮酸烯醇-酮式互变异构现象。采用以直径为0.3mm的碳微电极为工作电极的三电极系统，分离电压18kV，毛细管长度60cm，电泳液是添加了3mmol/L的β-环糊精溶液的pH=6.60、50mmol/L的磷酸盐缓冲液，两异构体在15min内实现基线分离。

烯醇式-酮式互变异构体，对羟基苯丙酮酸，毛细管电泳，安培检测

人体内酪氨酸代谢过程中会产生对羟基苯丙酮酸(p-hydroxyphenylpyruvic acid，pHPP)。对羟基苯丙酮酸的测定可以帮助诊断一些代谢紊乱所引起的疾病[1-2]。目前对于水溶液中其烯醇式-酮式互变异构现象的研究有高效液相色谱法[1]、电化学法[2]、毛细管电泳-紫外检测法[3-4]等，本文利用毛细管电泳-安培检测法(CE-AD)研究对羟基苯丙酮酸在水溶液中的互变异构现象，建立了分离测定其互变异构现象的新方法。

1 实验部分

1.1 设备与试剂

实验室自组装毛细管电泳-安培检测设备；未涂层石英毛细管(25μm i.d×60cm)，河北永年光纤厂；安培检测器(BAS LC-4C型)，美国西拉斐特；无极可调高压电源(0～30kV)，上海原子核研究所；三电极工作系统(工作电极为自制直径为0.3mm的碳微电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂

电极)；HW-2000色谱工作站，南京千谱软件有限公司。

β-环糊精(色谱纯)、pHPP(色谱纯)，美国Sigma化学品公司；水为Milipore高纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

实验用pHPP分别用水与甲醇溶解配制成5.0×10-3mol/L的储备液，冷藏于冰箱。实验时以缓冲液稀释。实验所用试液均需用聚乙烯滤膜(0.22 μm)过滤，超声波除去试液中细小气泡。实验前，毛细管需经碱洗、水洗清洁，经缓冲液活化15min。实验应用电动进样方式，进样时间10s，电压18kV，随后电泳分离与检测。实验在大约20℃的室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 pHPP烯醇式与酮式互变异构平衡

文献[4]报道，pHPP以甲醇配置溶液冷藏放置数十天不会发生异构转化，但pHPP在水溶液中发生由烯醇式(图1-A)向酮式(图1-B)转化的异构现象，平衡时多以酮式异构体存在。

图1 pHPP的互变异构体

2.2 检测电位

毛细管电泳-安培检测中，工作电极上电位的选择对检测的灵敏度、检测限和稳定性有重要的影响。在添加了3mmol/L的β-环糊精溶液的pH=6.60、50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，考察了pHPP烯醇式与酮式异构体的动态伏安性质。取异构充分的pHPP水溶液进行实验。烯醇式与酮式异构体的峰电流随检测电位的升高均显著增大；pHPP两异构体的峰电流在检测电位低于0.80V时明显减小；在高于1.00V的检测电位下，信噪比降低，基流升高；选择1.00V为工作电极的检测电位。

2.3 缓冲液

比较几种常见缓冲液(硼砂-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液，pH=6.60)对分离的影响。发现在磷酸盐缓冲体系中两种异构体的分离效果较好，峰形较对称。

考察浓度范围40mmol/L～80mmol/L的磷酸盐缓冲液对pHPP两种异构体分离行为的影响。两种异构体在缓冲液浓度低于50mmol/L时不能实现分离；在缓冲液浓度达到70mmol/L时，峰展宽，灵敏度降低，迁移时间延长。实验选定磷酸盐缓冲液浓度为50mmol/L。

考察pH值的影响，两种互变异构体在pH值大于6.10时实现分离；在pH=6.50时峰形变对称；继续升高pH值，峰展宽，迁移时间变长。实验选定pH=6.60为最佳pH值。

2.4 添加剂

β-环糊精与待测组分形成包合物有助于待测物的分离，也是选择β-环糊精作为添加剂的原因。β-环糊精分子结构是一个内空去顶、上宽下窄的锥形体，由7个D-(+)-吡喃葡萄糖组成。锥形体外部分布着分子中所有羟基，其中在宽口端顺时针方向指向排列着7个羟基，糖苷氧原子和氢原子位于其空腔内。该结构特点使β-环糊精具有亲水性外壳与疏水性内腔，易与一些有机物质形成主-客体包合物。pHPP分子中苯环靠其疏水作用由β-环糊精分子的锥形体宽口端进入，在腔内二者形成包合物，靠氢键作用结合两分子，其中β-环糊精与烯醇式结构的异构体间氢键作用更强，使包合物更稳定，并减少了其所带负电荷，使其出峰早于酮式异构体。

图2 β-环糊精与pHPP形成包合物的图示

考察了β-环糊精浓度在1mmol/L～5mmol/L范围内对分离效果的影响。加入β-环糊精增加了分离度，缩短了待测物迁移时间，改善了峰展宽；但当β-环糊精的浓度增加到4mmol/L时，两种互变异构体由于出峰时间的提前不能完全分开。Wren和Rowe[5]认为，添加剂存在一个最优浓度，大小受形成包合物的两物质的结合常数的影响；二者结合常数越小，所需添加剂浓度越高，反之则越低。同时加入β-环糊精使峰电流降低，由于β-环糊精是电中性的化合物，与待测物质包合后，使pHPP所带净负电荷减少，迁移速度加快。结合分离效果与出峰时间，选定3mmol/L为实验最佳添加剂浓度。

2.5 进样时间

进样时间过短则峰电流小，影响检测灵敏度；进样时间过长则会因样品的扩散引起峰展宽，使分离效率与分离度下降；综合考虑，设定进样时间10s。

2.6 分离电压

电泳速度、毛细管中的电场强度均由分离电压的大小来决定，分离度与分析时间进而受其影响。分离电压低于15kV时，分离物在毛细管内严重扩散，导致谱峰展宽、灵敏度下降；分离电压越大，出峰时间越短；但焦耳热增加，基流增高。综合考虑，选择18kV为实验电压。在以上所有最佳实验条件下，待测物的毛细管电泳谱图如图3所示。实验条件：5.0×10-5mol/L的 pHPP水溶液；pH=6.60，浓度为50mmol/L的PBS缓冲液；25μm i.d×60cm的毛细管；0.3mm碳圆盘微工作电极；1.00V的检测电位；10s的进样时间；18kV的分离电压。

A pHPP的烯醇式结构 B pHPP的酮式结构

图3 pHPP标准水溶液的电泳图

Fig.3 The electropherogram of standard solution of pHPP

2.7 方法重现性、线性范围与检测下限

在实验条件下，通过对5.0×10-6mol/L的pHPP标准溶液重复进样分析，对方法的重现性进行考察。峰高和迁移时间的相对标准偏差(RSD，n=3)分别为2.92%和3.26% 。

配制pHPP甲醇溶液，使pHPP完全以烯醇式结构存在，分别稀释为1.0×10-5mol/L～1.0×10-8mol/L浓度范围的待测溶液，对方法的线性范围进行考察，检测下限依据三倍信噪比原则确定，结果见表1。

表1 线性范围和检测下限

3 结论

应用毛细管电泳-安培检测法在β-环糊精做添加剂的条件下研究了对羟基苯丙酮酸的烯醇式与酮式异构体的拆分。结果表明，缓冲体系对异构体的分离与分析有很大的影响，选择合适的缓冲溶液及控制合适的pH值使分离有很大的提高，同时添加剂的选择使分离产生了很好的效果。

[1] 黄颖，张晓丽，陈国南.高效液相色谱法研究对羟基苯丙酮酸烯醇-酮式互变异构动力学[J].福建师范大学学报：自然科学版，2009，25(3)：77-79.

[2] 黄颖，张晓丽，占春荣，等.多壁碳纳米管修饰玻碳电极用于对羟基苯丙酮酸的电化学研究[J].福建师范大学学报：自然科学版，2010，26(3)：47-51.

[3] 郭晴，常理文，陈义.尿中微量芳香酸的高效毛细管电泳分析——用于苯丙酮尿症的诊断[J].分析化学，2001(9)：1000-1002.

[4] HUANG Lu，HUANG Ying，CHI Yu-wu，et al. Study on the kinetics of keto-enol tautomerism of P-hydroxyphenylpyruvic Acid using capillary electrophoresis [J]. J Chromatogr A，2007，10(78)：44-49.

[5] Wren S A C，Lukacs K D. Theoretical aspects of chiral separation in capillary electrophoresis：I. Initial evaluation of a model[J]. J Chromatogr A，1992，603：235-241.

Determination of the Tautomerization of p-Hydroxyphenylpyruvic Acid by CE

JIANG Xiu-yan，WANG Cong-cong

(School of Chemical Engineering Shengli College China University of Petroleum，Dongying 257061，Shandong，China)

The enol-keto tautomerism of p-hydroxyphenylpyruvic acid was investigated by capillary electrophoresis with amperometric detection. A three electrode system with a carbon microelectrode (i.d. 0.3mm) as the working electrode was used. The two tautomers were separated and detected within 15min at 18kV of applied voltage and a 60cm (i.d. 25μm) length capillary in 50mmol/L phosphate buffer (pH=6.60) including 3mmol/Lβ-cyclodextrin.

the enol-keto tautomerism，hydroxyphenylphruvic acid，capillary electrophoresis，amperometric detection

O 657.8