刘俊琦

（永州职业技术学院，湖南永州425000）

永州地区一典型副猪嗜血杆菌病的综合诊治

刘俊琦

（永州职业技术学院，湖南永州425000）

2016年5月，永州市零陵区某规模化猪场的保育猪出现跛行，呼吸困难，部分猪只出现死亡，经流行病学调查、临床症状、病例剖检以及实验室检测，诊断为副猪嗜血杆菌病。根据药敏试验结果，针对性用药，并结合综合防治措施，使病情得到有效控制。笔者将本次病例进行系统分析、总结，以期更好地指导养殖户开展诊治工作。

副猪嗜血杆菌；纤维素性；诊断；免疫

副猪嗜血杆菌为猪上呼吸道的一种常在菌，属于条件性致病菌，当外界环境发生改变或有引起免疫抑制的因素存在时，可引起严重的全身性疾病，以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。本病一年四季均可发生，常为散发性或地方流行性，有时呈大面积暴发[1]。随着现代养猪模式的变化，副猪嗜血杆菌病已成为全球范围内影响养猪业的一种主要的细菌性疾病，给养殖业带来了巨大的经济损失[2]。

2016年5月，湖南省永州市零陵区某规模化猪场共有保育猪894头，其中234头保育猪陆续出现体温升高、呼吸困难、跛行、震颤等症状。经抗生素治疗后，大部分猪只症状减轻，出现康复现象，但个别猪只经治疗后仍无明显好转，相继死亡56头。公司；TSA培养基购于青岛海博公司；接触酶、氧化酶、半乳糖、H2S、鸟氨酸、核糖、山梨醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、吲哚、脲酶、木糖、L-阿拉伯糖、蜜三糖、麦芽糖购自杭州天和微生物试剂有限公司；Taq-p lus酶、DNA Marker购自天根生化科技有限公司；副猪嗜血杆菌PCR检测引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1 材料与方法

1.1 材料

病料采集于湖南省永州市零陵区某规模化猪场疑似副猪嗜血杆菌发病仔猪；NAD购于成都贝斯特试剂有限

（1）临床诊断。询问养殖户本场猪只既往病史、疫苗免疫情况；观察不同病例症状。

（2）病理诊断。选择20头症状比较典型的患病猪进行剖检，观察病变。

（3）细菌的分离培养。无菌采集病死猪的肺脏、关节液、心血、淋巴结等组织，接种于含NAD因子的TSA或者TM／SN平板上划线接种，厌氧罐中37℃培养24～48小时后，挑取单个菌落进行纯培养，并对可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。

（4）生化鉴定。将分离所得可疑菌株的纯培养物分别接种于接触酶、氧化酶、半乳糖、H2S等量生化鉴定管中，每支生化管中同时加入1μL牛血清和1μL NAD的（V因子）置于37℃恒温培养箱，观察生化反应和糖发酵活性结果，重复2次。

（5）PCR诊断。以可疑菌株为模版，按照副猪嗜血杆菌（GenBank：M 75065）的保守序列16s RNA设计引物（上游引物：5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT 3’；下游引物：5’GGCTTCGTCACCCTCTGT 3’）。PCR扩增反应参数为：94℃预变性5m in，然后94℃变性30 s，65℃退火30 s和72℃延伸2m in，25个循环后再72℃延伸7 m in，4℃保存。反应结束后取5μL的PCR产物，用1%的琼脂糖电泳检测扩增结果。

（6）药敏试验。用灭菌接种环以划线方式将细菌均匀涂布到平板皿培养基中，取药敏片紧贴培养皿表面，37℃温箱中培养24小时后，测量抑菌环直径并判定结果。

2 结果

2.1 临床症状

经调查，该猪场过去未有副猪嗜血杆菌病大规模暴发历史，也未注射副猪嗜血杆菌病疫苗。急性病例可见病猪精神沉郁，体温升高，个别猪只体温升高至41.5℃，食欲不振，不愿站立，咳嗽，腹式呼吸，关节肿胀，出现跛行，共济失调，四肢划动，震颤，可视黏膜发绀，卧地不起，随之部分猪死亡。慢性病例表现为体温升高，皮肤苍白，被毛粗糙，生长缓慢，轻微脑膜炎，关节炎，肺炎。

2.2 病理变化

肉眼可见胸水、腹水增多，胸腔内有大量的淡红色液体和纤维素性渗出物凝块；心包有纤维素性渗出物，心包膜与心脏粘连；纤维素性化脓性支气管肺炎，部分肺脏发生粘连、肿胀、出血、淤血；全身淋巴结肿大、出血，切面呈大理石样花纹。

2.3 细菌的分离培养

显微镜下观察到无芽孢的革兰氏阴性短小杆菌，该菌在麦康凯培养基和普通琼脂培养基上不生长。且将单菌落与金黄色葡萄球菌垂直划线于无NAD的血平板上，在37℃培养24～48小时，可看到“卫星生长现象”，且无溶血现象，初步判断该菌为副猪嗜血杆菌[3]。

2.4 细菌生化鉴定结果

将分离菌落分别接种于生化培养基中，37℃培养，其结果见表1，符合副猪嗜血杆菌的生化特性。

2.5 PCR确诊

以可疑菌株为模版，经PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一段大小为821 bp的特异性条带，见图1，确诊该菌株为副猪嗜血杆菌[4]。

图1 PCR鉴定阳性副猪嗜血杆菌结果M：核酸分子质量标准（DL2000）；1：阳性菌落

2.6 分离菌药敏试验结果

对分离到的细菌进行药敏试验，测量抑菌环直径，其判断标准为：抑菌圈直径小于15 mm的为不敏感，15～20mm的为中度敏感，20mm以上的为高度敏感。结果表明该菌对头孢噻呋、氯霉素、氟苯尼考、替米考星、青霉素、氨苄西林、头孢克洛、环丙沙星敏感；对泰乐菌素、磺胺-6-甲氧嘧啶中敏；对红霉素、四环素、林可霉素、氨基糖苷类有抵抗力，结果见表2。

表1 分离菌生化鉴定结果

表2 药敏试验结果

3 结论与讨论

3.1 治疗

通过药敏试验，对患病猪注射氟苯尼考进行治疗，每10 kg体重肌肉注射1m L，1次/天，可配合地塞米松注射液；或头孢噻呋注射液，每kg体重肌肉注射5mg，1次/天。经该方案治疗3周后病情得到有效控制，共计死亡56头，治愈178头，治愈率为76%。

3.2 讨论

本次猪场发生的副猪嗜血杆菌病是由多种因素综合叠加引发的，主要有以下因素：⑴5月份该地区出现异常的低温、潮湿、多雨气候，而养殖户未根据气候变化及时做好保暖、通风。建议养殖户注意猪舍的通风保暖，供给猪群足够洁净的饮水，可添加维生素C粉和电解质饮水5～7天，以增强猪只抵抗力。⑵该养殖场卫生条件非常差，由于该场猪圈采用传统水泥地板，粪便与尿液随处可见，臭气熏天。建议彻底清扫猪舍，及时清除病死猪及粪便，做好无害化处理工作。粪便经2%火碱溶液消毒处理后集中堆积发酵；受污染的栏舍、通道、食槽、墙面、饲养用具等应该先用清水彻底冲洗后，用2%氢氧化钠溶液喷洒地面和墙壁，2小时后用清水冲洗干净，再选用刺激性小的消毒药物消毒，1次/天，连用4～5天，以后圈舍每周进行1次彻底的清扫和消毒；此外，建议猪场使用漏缝地板，以便于粪、尿的清除。⑶随着近期市场行情较好，养殖户饲养热情较高，从而大量引进猪只，造成猪群饲养密度过高，猪只活动范围小，使得环境应激因素增多。建议养殖户加强饲养管理，实行“全进全出”饲喂体系；严格禁止不同批次的猪只混养，舍内保持合理的饲养密度；消除诱因，减少各种应激，在猪群转群、混群前后可在饮水或饲料中添加一些抗应激药物；定期灭鼠、灭蚊蝇、杀虫消毒，防止犬类、猫类等其他动物进入生产区。⑷据调查，该猪场未使用副猪嗜血杆菌疫苗免疫，对副猪嗜血杆菌病的防治意识比较薄弱。建议猪群使用副猪嗜血杆菌多价油乳剂灭活苗，怀孕母猪产前50日首免，3周后二免，以后每胎产前4周免疫1次；种公猪每半年免疫1次；仔猪1周龄首免，3周龄后二免。⑸两个月前该猪场曾感染过猪蓝耳病，估计由于猪群感染蓝耳病后免疫功能下降，副猪嗜血杆菌伺机暴发，从而导致严重的经济损失。已有研究证实，副猪嗜血杆菌常作为继发的病原伴随其他病原混合感染，通常副猪嗜血杆菌被认为是随机入侵的一种次要病原，属于典型的“机会主义”病原。大量临床病例表明，本病常与猪瘟、猪圆环病毒病、口蹄疫、猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪肺疫、猪链球菌病、猪流感等混合感染或继发感染。因此，控制上述病的感染是预防副猪嗜血杆菌病的关键因素。建议在做好本病疫苗防疫工作的同时，应及时对猪瘟、猪圆环病毒病等传染病进行免疫。但需注意的是，在保育阶段尽量减少注射疫苗，尤其是口蹄疫疫苗，如果母源抗体处于高免状态，可推迟到60～70日龄免疫。

细菌的分离鉴定对副猪嗜血杆菌病的确诊是必要的，但是通常很难成功。这是由于副猪嗜血杆菌是非常“娇嫩”的细菌，对培养基又有较高的要求，当标本中出现其他细菌时，很难确认采集的标本中是否存在副猪嗜血杆菌。有学者认为副猪嗜血杆菌病真实的发病率可能为报道的10倍之多。因此建议将细菌分离与血清学诊断和分子生物学诊断相结合，以提高诊断准确性。

病猪要早发现、早治疗，疗效才好。虽然部分抗生素能有效地治疗副猪嗜血杆菌病，但须注意的是副猪嗜血杆菌耐药性很强，是当前猪场所有致病菌中耐药性产生速度最快的一种细菌。研究表明，通常一种敏感的抗生素，使用半年后细菌就开始耐药（需要加大剂量），一年后便完全失效。因此，建议选平时未用过或很少使用的药物，并轮换使用药物，避免产生耐药性。此外，配合使用抗病毒药物，如干扰素、黄芪多糖等，能有效地控制病情，避免继发感染。

[1]肖卫华,郭田华.副猪嗜血杆菌病的诊断与治疗[J].中国农业信息,2014(12):96.

[2]陆国林,何海健.副猪嗜血杆菌病的研究进展[J].中国畜牧兽医,2009,36(12):162-165.

[3]陈勇,高艳,张定全,等.副猪嗜血杆菌的分离鉴定与培养基筛选[J].动物医学进展,2013,34(10):67-71.

[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:120-126.

S852.61

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1673-4645(2017)06-0086-03

2017-02-05

刘俊琦（1984-），女，湖南永州人，硕士研究生，主要从事分子生物学与免疫学教学与研究工作，E-m ail：liujunqi215215@163.com