王国君 陈利军 熊建伟 智亚楠

摘要：为了筛选出对茶树炭疽病病菌具有拮抗作用的根际促生细菌，从河南省信阳市茶园采集85份土样，分离得到23株具有拮抗作用的细菌，利用平板对峙法筛选出对胶孢炭疽菌具有较强拮抗作用的7株细菌菌株，且其代谢产物对茶树炭疽病病菌的平均抑制率达到53.20%。依据生理生化特征经初步鉴定，7株拮抗菌株均隶属于芽孢杆菌属。试验结果为进一步构建多功能植物根际促生菌广适菌群提供菌株资源。

关键词：茶树；炭疽病病菌；拮抗作用；根际促生细菌；筛选

中图分类号： S435.711文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0076-03[HS）][HT9.SS]

茶树炭疽病是一种由真菌侵染引起的病害，是常见的茶树叶部病害之一，在我国各产茶区均有发生，山区茶园尤为普遍[1]，该病发病严重时可导致茶树大量落叶，并造成茶树树势衰落和茶叶产量与品质降低，还影响翌年春季茶叶的产量。

目前，茶园主要利用化学药剂防治茶树炭疽病，但长期使用化学药剂会导致病原菌抗药性增强，并可造成农药残留、环境污染等一系列问题。在化肥农药零增长的大背景下，如何开发生物制剂来防治茶树炭疽病尤为重要。植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR）指生存于植物根际、根表，并能直接或间接地促进或调节植物生长的微生物[2]，它能够通过多种机制促进植物的生长，目前人们普遍认同的生物学功能主要有拮抗病原菌、诱导系统抗性、改善根际微生态环境等[3]。国外研究人员已从水稻、小麦、玉米、甘蔗和棉花等作物根际分离筛选出许多高效、优良的促生菌株，并且部分菌株已实现商业化[4-6]。陈波等分离筛选出对樱桃生长有明显促进作用的假单胞菌属（Pseudomonas sp.）[7]；史国英等分离得到1株对甘蔗具有促生作用的细菌，经鉴定为克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）细菌[8]；周晨昊等研究发现，将筛选到的1株植物根际促生细菌JD37与蚯蚓粪混合对小白菜与蕹菜具有显著的促生作用，其鲜质量和产量均有明显提高，还具有降低2种蔬菜中亚硝酸盐含量的作用[9]。

本研究从茶树根际土壤中分离PGPR，初步研究其对茶树炭疽病病菌的拮抗作用，通过形态学和生理生化特性对其鉴定，为构建高效广适促生菌群提供菌株材料。

1材料与方法

1.1供试样品

从河南省信阳市浉河港镇、董家河、震雷山、信阳农林学院等地的茶园中，共采集85份根际土壤样品，放入自封袋，分别标记为SHG、DJH、ZLS、XYNL，并加以编号，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2供试培养基[10]

PDA培養基：200 g去皮马铃薯、20 g葡萄糖、18 g琼脂；NA培养基：5 g牛肉浸膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl、18 g琼脂、pH值为7.2；NB培养液：3 g牛肉浸出膏、5 g蛋白胨、5 g NaCl、1 000 mL水、pH值为7.0～7.2。

1.3供试病原真菌

盘长孢菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）由信阳农林学院农药学实验室分离和保存。

1.4细菌的分离和纯化

称取10 g土样，加入装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，于120 r/min摇床上振荡30 min，即为10-1稀释液，取 1 mL 10-1 稀释液加入盛有9 mL无菌水的试管中，即为10-2稀释液，依此类推，用无菌水稀释成10-3～10-7稀释液，分别取5 μL涂布于3种固态培养基平板上，每个浓度重复3次，置于26～27 ℃恒温箱中培养3～5 d后，挑取单菌落作为参试菌株。

1.5对茶树炭疽病病原菌拮抗作用的测定

1.5.1[JP2]细菌菌株对茶树炭疽病病原菌拮抗性测定

采用对峙生长法测定茶树根际细菌对胶孢炭疽菌的拮抗性。即在直径为9 cm的PDA平板正中央接入直径为5 mm的胶孢炭疽菌菌块，同时在距平板中心2.5 cm处的4个点上分别接入1环目标细菌菌落，对照不接筛选菌株，只接入培养基，于 27 ℃ 恒温箱内培养72 h，测量从茶树根际土壤中筛选的细菌的菌落边缘和茶树炭疽病病原菌菌落边缘之间的抑菌带宽度，筛选出对茶树炭疽病病原菌具有拮抗作用的菌株。同时观察筛选菌的菌落大小和生长速度，选出拮抗作用明显的细菌。[JP]

1.5.2拮抗细菌代谢产物对供试病原菌的抑制作用

将初筛的拮抗细菌于NB培养液中28 ℃振荡培养3 d，将发酵液以8 000 r/min离心15 min，取上清液，最后用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，每个处理重复3次。将2 mL无菌滤液和20 mL NA培养基混合均匀倒入培养皿，冷却凝固后，在每个培养皿中央接入直径为5 mm的供试病原菌菌块，27 ℃下培养24 h。以直接培养的炭疽菌作为对照，用垂直十字法分别测量含测试菌发酵液条件下和不含发酵液条件下的病原菌菌块直径，用如下公式计算抑制率：

[JZ]抑制率=[SX（]对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径[SX）]×100%。

1.6拮抗菌株的初步鉴定

对拮抗菌株进行革兰氏染色、芽孢染色、硝酸盐还原反应、伏-普（V-P）反应、柠檬酸盐利用反应、淀粉水解、厌氧性试验、接触酶反应，以及葡萄糖、蔗糖、甘露醇产酸等形态学及生理生化分析，对拮抗菌株进行初步鉴定。

2结果与分析

2.1不同样品中分离的细菌菌株及拮抗菌株

从85份根际土壤样品中分离细菌，对分离出的根际细菌根据其菌落形态、颜色等挑取单菌落，按常规方法纯化后保存，共获得254株细菌菌株，根据菌落的形态特征，经过进一步筛选，发现具有拮抗作用的菌株23株，其中7株菌株对茶树炭疽病病原菌具有较强的拮抗作用。如表1所示，7株目标拮抗菌株主要来自震雷山茶场、浉河港镇何家寨茶场、董家河尖山茶场。菌株来源相对分散，相比较而言，化学防治较少的震雷山茶场分离得到的菌株较多，从侧面反映化学杀菌剂的使用可能导致茶树根际微生物种群中有益微生物的数量减少。另外，7株菌株均出自相对肥沃的土壤，这与孙海新等的研究结论[11]一致。从茶树品种来看，4株菌株来源于福鼎大白茶、2株来源于龙井43、1株来源于白毫早，而福鼎大白茶在茶区种植面积较大，因此，不同茶树品种对拮抗菌株是否存在一定的影响需要进一步研究证明。

2.4拮抗细菌的鉴定

由表4可知，7株拮抗细菌革兰氏染色反应、芽孢染色反应、硝酸盐还原反应、V-P测定、柠檬酸盐利用反应、运动性、淀粉水解反应、接触酶反应、葡萄糖产酸、蔗糖产酸、甘露醇产酸反应等均呈阳性，厌氧性试验均呈阴性。根据细菌形态特征观察和生理生化反应结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《芽孢杆菌属》[13]，初步确定这7株菌株均属于芽孢杆菌属。

3结论与讨论

目前，植物根际促生细菌的筛选利用及其促生机制的研究已成为一个热点[14-15]。从本试验筛选的初步结果看，7株菌株代谢产物平均拮抗抑制率为53.20%，经生理生化鉴定，7株菌株均为芽孢杆菌属。虽然拮抗抑制率与申光辉等所筛选的拮抗菌株的拮抗抑制率[16]有差距，但是并不能简单认为其生防效果不理想。因为拮抗作用只是促生细菌作用中的一个方面，需要从多个方面综合筛选方可成功开发出生产中具有意义的微生物农药。另外，拮抗菌株在室内和田间表现的稳定性往往存在差异，有研究表明物理、化学、微生物种群等环境条件会对细菌生长造成影响，从而制约其促生效果[17]。因此，在室内试验中拮抗效果不突出的菌株，并不意味着不具有开发价值。要将所筛菌株在农业生产上用于防治植物病害，尤其是防治茶树炭疽病还需进一步通过田间试验来验证，如果田间防治效果较好，那么对于其产生的抗菌活性物质有效成分的分离、纯化、结构鉴定等都值得进一步研究。另外，促生机制具有多样性，能否将7株菌株构建适应不同环境要求的多功能菌群以共同发挥作用也需要进一步研究。

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