倪雅楠+刘博

摘要：以龙爪槐（Sophora japonica f. pendula Hort.）叶片为材料，采用L16（45）正交设计试验，对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5个因素进行优化，并确立适用于龙爪槐SRAP-PCR反应的最佳体系。结果表明，龙爪槐SRAP-PCR反应的最佳体系为反应总体积12.5 μL，Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均为1.2 nmol/L、DNA 100 ng，其余体积用ddH2O补足。各因素水平变化对反应体系的影响影响大小依次为引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。用35个龙爪槐样品对优化体系进行验证，均得到条带清晰、多态性丰富的图谱，证实了该体系的稳定性。

关键词：龙爪槐；SRAP-PCR；正交试验；反应体系优化

中图分类号： S687.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）11-0019-03

相关序列扩增多态性（sequence related aplified polymorphism，SRAP），是美国加州大学蔬菜作物系Li等在芸薹属（Brassica）中开发出的，利用1对独特的引物设计方式实现对开放阅读框架ORFs进行扩增的标记[3]，适合于植物的遗传多样性研究、比较基因组学、遗传图谱的构建等领域研究。笔者首次采用SRAP技术对龙爪槐的遗传多样性进行分析，因此，须要确定其SRAP-PCR的最佳反应体系。

正交试验能综合各因素及其相互作用，快速找到影响因素的最佳水平组合，不仅效率高，且结果稳定可靠。正交试验已被广泛应用到菊花、荷花和番茄的优化体系中，并已确定最佳的反应体系[4-6]。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为采自北京市35株龙爪槐的嫩叶（表1），硅胶

1.3.4龙爪槐SRAP-PCR最佳反应体系验证以35份龙爪槐的基因组DNA为模板，随机选取2个SRAP引物组合ME1-EM7、ME8-EM8，按照上述扩增及检验方法，对优化的龙爪槐SRAP-PCR反应体系进行检测。

1.4数据的统计与分析

采用Excel软件对试验结果进行统计和分析。

2结果与分析

2.1龙爪槐SRAP-PCR反应体系的确立

2.1.1试验材料基因组DNA检测部分试验材料的DNA琼脂糖电泳检测结果见图1，DNA条带清晰、完整，符合SRAP对DNA的要求。

2.1.2正交试验结果分析根据正交试验表，每个处理重复3次，得到的电泳结果见图2，采用不同的反应体系扩增结果存在明显差异。第1、6、9、10、12、14、15、16组扩增效果较差，条带不清晰稳定性差；2、11组重复性差，反应体系弥散严重，条带不清晰；4、5、7、8组扩增效果较好，但2、3、5、7、8组条带丰富性差。综合以上分析，根据条带丰富度、清晰度以及重复性等因素初步确定第4组为最佳反应体系。

2.2龙爪槐最佳SRAP-PCR反应体系验证

应用上述筛选出的龙爪槐最佳反应体系，选取2个引物组合ME1-EM7和ME8-EM8对35个龙爪槐样品进行PCR扩增。结果（图3）显示，随机选取的这2个引物组合能应用筛选得到的最佳體系扩增出丰富的条带，且图谱条带清晰、稳定性好，证明该最佳体系可以应用到龙爪槐基因组DNA的SRAP-PCR反应中。

3讨论

龙爪槐在我国具有悠久的栽培历史，是园林造景中不可缺少的树种，目前关于龙爪槐的研究仅局限于嫁接技术、虫害防治方面[8-13]，对于龙爪槐分子生物学方面的研究还未见报道，因此本研究旨在探究龙爪槐分子水平上的特征，评价龙爪槐的遗传结构和变异，为龙爪槐种质资源的搜集、保存和利用提供理论依据，并为龙爪槐的分子水平研究奠定一定的基础。

对PCR反应体系的优化有单因素试验和正交试验2种方法，单因素试验不能兼顾到各因素之间的相互作用，无法分析各组分不同水平对扩增结果影响的差异显著性，且单因素试验次数多，耗时耗力成本较高；正交试验与单因素试验相比节省试验时间，用较少的试验次数便可获得可靠的试验结果，并能通过数据反映出各因素间的交互作用。本研究通过正交试验对影响SRAP-PCR的5个因素和4个水平进行优化和筛选，最终确定龙爪槐SRAP-PCR的最佳反应体系为反应总体积12.5 μL，Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均为1.2 nmol/L，DNA 100 ng，其余体积用ddH2O补足。

反应体系中的各个因素之间会产生相互作用，每种因素发生变化都可能影响扩增的结果。本试验研究结果显示，各个因素对龙爪槐SRAP-PCR的影响大小依次为引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。通过查阅相关文献发现，SRAP-PCR反应体系针对不同物种的分析中，每个反应因素对物种的影响程度均有所不同，因此SRAP-PCR反应体系必须针对不同物种和试剂的差异对主要的影响因素进行优化，保证试验结果的稳定性和可靠性。

随着分子生物学的不断发展，分子标记技术已被广泛用于植物的遗传多样性研究中[14]。陈兴彬利用筛选出的多态性高、扩增稳定的7对引物对11个黑松群体进行扩增，共扩增出73个条带，其中59个多态性条带，多态性条带比率为80.82%，平均每对引物扩增出10.4、8.4个多态性条带[15]；Pinar等用过SRAP标记对地中海地区57株野生杏的遗传多样性进行分析，其中19对引物中有16对可以扩增出多态性条带，扩增出的87段条带中，有56段具有多态性，多态性条带比率为64.37%[16]。在本试验中应用SRAP技术，使用随机选取的2个引物对，对35份龙爪槐样品进行分析，获得32个条带，多态性条带有26条，多态性比率为81.25%。以上研究可以看出，SRAP技术扩增条带丰富度、多态性均较高，且试验过程中具有较高的稳定性和重复性；SRAP技术可以在未知基因组序列信息的条件下使用，所用引物也具有通用性，因此，SRAP技术适用于龙爪槐遗传多样性的研究，同时

也为对龙爪槐进行资源鉴定、基因定位等方面的研究奠定了一定的基础。

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