刘宽，苏佳，杨韵渲，张璐，何庆峰

（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384）

半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白酶法提取工艺研究

刘宽，苏佳，杨韵渲，张璐，何庆峰*

（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384）

半滑舌鳎在沿海地区被广泛养殖及食用，其鱼皮可能成为制备食品胶原的良好材料来源。本研究以胶原得率为指标，考察了酶提法提取鱼皮胶原的影响因素（蛋白酶添加量，酶提取时间，酶提取温度），并采用响应面试验优化了最优提取工艺。结果表明，鱼皮胶原蛋白得率最优提取条件为：酶添加量为1.06%，提取温度为4℃，提取时间为19.5 h。在此条件下，鱼皮胶原提取率为42.1%。进一步的营养分析发现，提取的鱼皮胶原中粗蛋白含量为89.76%，灰分含量为1.37%，脂肪含量0.81%，水分7.52%。

半滑舌鳎；胶原；鱼皮；响应面设计

胶原蛋白广泛的存在于动物的皮肤、骨骼、结蹄组织，被广泛的应用于摄影，化妆品，生物材料及医药等行业[1]。此外，由于胶原蛋白能增强食品材料的黏度，弹性及稳定性，其又被广泛应用食品行业，如食品封装，胶囊的制作及可食胶原的生产。目前，商业胶原蛋白的生产主要是以牛、猪的皮肤、骨、结缔组织为原料，而疯牛病及手足口病等食品安全问题的爆发，以及宗教问题迫使人们开发新的胶原蛋白生产原料。鱼皮是鱼产品加工企业常见的下脚料，若被丢弃会造成极大的浪费及环境污染[2]。因此，鱼皮胶原蛋白的提取研究一直是食品行业的研究热点之一，国内外已有较多关于鱼皮胶原的报道[3-4]，但鱼皮胶原蛋白提取效率及特性受提取方法及鱼皮来源的影响较大[5-6]。

半滑舌鳎属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，俗称“龙脷”、牛舌头、鳎目，是一种暖温性近海大型底层鱼类。其肉质鲜美，营养丰富，在渤海地区尤其是天津地区被广泛养殖和食用，深受人们喜爱。半滑舌鳎一般被去皮加工冷冻成鱼段、鱼排出售，而大量的鱼皮下脚料是加工胶原蛋白的良好原料。此外，大量研究表明，暖温性海水鱼的胶原特点及亚氨基酸（脯氨酸及羟脯氨酸）含量优于冷水鱼[7-8]。因此，半滑舌鳎鱼皮应该是制备胶原蛋白的良好原料。但到目前为止，还没有关于半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取工艺的相关报道。本研究以天津地区养殖的半滑舌鳎鱼皮为原料，研究了其胶原蛋白的酶法提取工艺，为半滑舌鳎鱼皮的有效利用和商业开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

半滑舌鳎鱼皮：天津红旗水产批发市场；胃蛋白酶（10 000 IU/g）：天津明川生物试剂公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 试验仪器

SHZ-82恒温震荡器：金坛市万华实验仪器厂；BCD-256KFB恒温冰箱：青岛海尔有限公司；YB-FD-1真空冷冻干燥机：上海亿倍实业有限公司；KQ-500DE超声清洗器：昆山舒美超声仪器有限公司；EX224型电子天平：OHAUS/奥豪斯仪器（上海）有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 半滑舌鳎鱼皮胶原提取工艺流程

具体工艺流程参考文献[9]。

1.3.1 鱼皮预处理

新鲜半滑舌鳎鱼取皮洗净晾干，自来水洗涤3次并切成小块（1 cm3），真空包装并储存在-20℃直至进一步使用。

1.3.2 脱色、除杂蛋白

以含1%H2O2，3%NaCl及0.1 mol/L NaOH溶液处理鱼皮6 h，离心，除去废液，得碎鱼皮。

1.3.3 除脂

将脱色除杂蛋白后的碎鱼皮用去离子水洗至中性，加入乙醚/异丙醇/蒸馏水（2∶2∶8，体积比）浸泡12 h，去除脂肪。

1.3.4 酶解

以胶原蛋白得率为指标，在pH2.0～3.0条件下，以胃蛋白酶进行胶原蛋白提取，对加酶量（加酶量/鱼皮重量）、酶解温度、酶解时间进行单因素试验，在此基础上进行响应面试验设计，确定最优酶提条件。酶解液过滤，8 000 r/min低温离心20 min，取上清液。

1.3.5 盐析

将酶解液离心后取上清液，pH调至中性，边搅拌边缓慢加入（NH4）2SO4，至其浓度达到1.5 mol/L，10 min内完全溶解，静置10 h～12 h。然后低温离心，收集沉淀。

1.3.6 透析

将沉淀用0.5 mol/L的醋酸洗脱，低温保存。

1.3.7 冷冻干燥

透析液冷冻干燥，即得鱼皮胶原蛋白提取物。

1.4 胶原蛋白得率的计算

1.5 鱼皮基本成分分析

水分：GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》；灰分：GB 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；蛋白质：GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；脂肪：GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》。

1.6 舌鳎鱼皮胶原蛋白提取条件单因素试验及响应面设计

选取胃蛋白酶添加量，酶提取时间，酶提取温度为考察因素，以胶原蛋白提取率为指标，在单因素研究的基础上，采用Design expert软件设计三因素三水平Box-Behnken优化试验。试验因子编码见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平及编码Table 1 Level and code of Box-Behnken test factors

2 结果与分析

2.1 半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取的单因素试验

2.1.1 胃蛋白酶添加量对半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取率的影响

在固定提取时间6 h，提取温度4℃的条件下，分别在0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%胃蛋白酶添加量（胃蛋白酶添加量/鱼皮质量）提取鱼皮胶原蛋白，考察不同胃蛋白酶添加量对半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白得率的影响，结果如图1所示。

图1 胃蛋白酶添加量对半滑舌鳎鱼皮胶原得率的影响Fig.1 Effect of pepsin addition on the yield of collagen from TS skin

由图1可知，在0.1%～1%范围内，随着酶添加量的增加，胶原蛋白得率也随之增加。当添加量为1%时，提取率最高，为26.7%。当酶添加量超过1%时，胶原蛋白得率随着酶添加的升高而降低。

2.1.2 酶提取温度对半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取率的影响

在固定提取时间6 h，胃蛋白酶添加量为0.1%的条件下，分别在0、4、10、20、30℃下提取鱼皮胶原蛋白，考察不同酶提温度对半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白得率的影响，结果如图2所示。

图2 酶提温度对半滑舌鳎鱼皮胶原得率的影响Fig.2 Effect of enzymatic temperature on the yield of collagen from TS skin

由图2可知，胶原得率随温度的升高先增加后下降，在0℃～4℃范围内提取率快速升高，当温度达到4℃左右，胶原蛋白得率达到最高，当温度在4℃～10℃时，胶原蛋白得率下降趋势不明显，而超过10℃后，胶原蛋白得率快速下降。

2.1.3 提取时间对半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取率的影响

在固定提取温度为4℃，酶添加量为0.1%的条件下，分别在6、12、18、24、30 h下提取胶原蛋白，考察不同提取时间对半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取率的影响，结果如图3所示。

图3 酶提取时间对半滑舌鳎鱼皮胶原得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic time on the yield of collagen from TS skin

由图3可知，提取时间6 h～12 h之内，胶原蛋白得率随着提取时间的增加，上升趋势比较明缓慢，而在12 h～18 h之内，胶原蛋白得率增速较快，而提取时间超过18 h后，胶原蛋白得率随提取时间的变化趋势较小。

2.2 响应面设计最佳条件分析

半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白响应面分析试验设计及结果见表2。

表2 半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白响应面分析试验设计及结果Table 2 Experimental design and result of response surface analysis of collagen from TS skin

如表2所示，经回归分析得到胶原得率与影响因素的回归方程如下：

Y=41.96+1.71A-1.63B+1.89C-6.28A2-3.70B2-3.63C2-0.27AB-1.20AC-0.32BC

半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白得率回归模型方程方差分析见表3。

表3 半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白得率回归模型方程方差分析Table 3 Variance analysis of collagen yield regression model of TS skin

由表3可知，胶原得率预测方程模型达到极显著水平（P=0.001 3＜0.01），失拟项不显著（P=0.053 2＞0.05）说明该回归模型预测能力较好，可以用此模型代替试验真实点预测实验结果。根据各项方差大小，预测提取条件对胶原蛋白提取率的影响排序为酶提取时间＞酶添加量＞酶提取温度。模型的一次项（A、B、C），二次项（A2，B2，C2）的回归系数极显著（P＜0.01），说明对胶原蛋白提取率的影响较大。而其他项不显著，表明对胶原蛋白提取率的影响不是简单的线性关系。根据Design Expert软件分析得出的最佳优化条件为：酶添加量为1.06%，提取温度为3.82℃，提取时间为19.51 h。在此条件下，半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白得率的预测值为42.5%。考虑到实际操作，将最优提取条件调整为：酶添加量1.06%，提取温度4℃，提取时间19.5 h，此条件下，胶原蛋白得率为42.1%，与预测值较符合。

2.3 半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取工艺的响应面分析

图4 半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白得率响应面图Fig.4 The response surface of collagen protein from TS skin

半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取工艺的响应面分析见图4。如图4a～图4c所示，酶添加量、酶提取温度和酶提取时间的交互作用的响应面图具有相似的变化趋势。但涉及到酶添加量和提取时间的响应面图变化明显，而酶提取温度与其它提取条件的响应面图变化较平缓。因此，在本次考察的酶提工艺中，酶添加量和提取时间对胶原蛋白得率的影响的交互作用比较强。图4d表明，回归方程的预测值与实测值一致性高，进一步说明回归方程拟合度高，能较好的预测胶原蛋白提取率。

2.4 半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白营养分析

半滑舌鳎鱼皮及其提取物营养分析见表4。

表4 半滑舌鳎鱼皮及其提取物营养分析Table 4 Nutritional analysis of the TS skin and its collagen extract

3 结论

本研究通过单因素试验探讨了胃蛋白酶添加量，酶解温度，酶解时间对半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取的影响。采用响应面分析建立的半滑舌鳎鱼皮胶原蛋白提取回归模型方程显著，可用于预测鱼皮胶原蛋白得率。最优工艺条件：酶添加量为1.06%，提取温度为4℃，提取时间为19.5 h。在此条件下，半滑舌鳎鱼皮胶原提取率为42.1%。本试验中，最优工艺条件下提取的半滑舌鳎鱼皮胶原粗蛋白含量为89.76%，粗脂肪含量为0.81%，灰分含量为1.37%，水分含量7.52%。本工艺条件不仅保证了较高的鱼皮胶原蛋白得率，而且较大降低了粗脂肪、水分的含量，符合食品行业应用的标准。

参考文献：

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[3]Subhan F,Ikram M,Shehzad A,et al.Marine Collagen：An Emerging Player in Biomedical applications[J].J Food Sci Technol,2015,52 (8)：4703-4707

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Extraction Optimization of Collagen from the Skin of Half-smooth Tongue Cole（Cynoglossus semilaevis Gunther）Using Resonse Surface Methodology

LIU Kuan，SU Jia，YANG Yun-xuan，ZHANG Lu，HE Qing-feng*
（College of Food Science and Bioengineering，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Half smooth tongue sole is widely cultured and edible in coastal area.Half smooth tongue skin was considered to be one of potential resources for the preparation of food collagen.Response surface method was used to optimize the processing conditions for the extraction of collagen from half-smooth tongue sole skin.Con

centration of pepsase，extraction time and temperature were selected as the independent variables.The results showed that the most suitable conditions for maximum collagen yield were the pretreatment with 1.06%pepsase ratio at 4℃for 19.5 h.The obtained collagen yield from the optimal conditions was 42.1%.The further nutrition analysis revealed that the obtained tongue sole（TS）collagen contained the content of 89.76%crude protein，1.37%ash，0.81%fat and 7.52%water content.

half-smooth tongue sole；collagen；fish skin；response surface methodology

2016-11-15

国家级大学生创新创业训练计划项目（201510061099）

刘宽（1992—），男（汉），本科，研究方向：食品质量与安全。

*通信作者：何庆峰（1979—），男（汉），讲师，博士研究生，研究方向：食品安全与毒理。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.006