胡宁宁，郭慧琴，李西良，孔令琪，武自念，张继泽，常 春，万东莉，臧 辉，任卫波(.中国农业科学院草原研究所,内蒙古 呼和浩特 0000； 2.中国农业科学院研究生院,北京 0008；.内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 0008)



植物生产层

羊草不同组织实时定量PCR内参基因的筛选

胡宁宁1,2，郭慧琴3，李西良1，孔令琪1，武自念1，张继泽1，常 春1，万东莉1，臧 辉1,2，任卫波1
(1.中国农业科学院草原研究所,内蒙古 呼和浩特 010010； 2.中国农业科学院研究生院,北京 100081；3.内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 010018)

为筛选羊草(Leymuschinensis)不同组织实时定量PCR(qRT-PCR)试验体系中的最佳内参基因，以羊草叶、茎、根、穗为研究材料，利用qRT-PCR技术分析TUA、TUB、18SrRNA、EF-1α、APRT、CYP、Actin和CBP20共8个常用候选管家基因的表达情况，并使用geNorm和NormFinder软件进行综合评价，以期筛选出羊草不同组织中最稳定的内参基因。结果表明，8个候选内参基因在羊草不同组织表达稳定性不同，其中，叶片中稳定性较高的内参基因是Actin；茎中稳定性较高的内参基因是EF-1a；根中稳定性较高的内参基因是APRT和18SrRNA；穗中稳定性较高的内参基因是TUB。本研究结果将为开展羊草功能基因的表达分析提供重要参考。

羊草；qRT-PCR；内参基因；组织

实时定量PCR(real-time quantitative PCR)是一种PCR技术，常用于基因表达检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好以及高通量等优点[1]，已成为当今植物分子生物学领域检测基因表达与转录组分析等研究的重要方法之一[2]。qRT-PCR包括绝对定量和相对定量两种方式，常用到的是相对定量。在相对定量检测中，通常会选择内参基因来校正数据，用来消除试验过程中如RNA提取质量、反转录cDNA效率及PCR反应条件可能带来的差异，使目的基因在试验样品中表达数据更准确。

在qRT-PCR中，使用稳定的内参基因是精准试验数据的前提[3]。理想的内参基因，应该是在所有的生理状态下都能稳定地表达。然而，有大量研究证实，在同一物种的不同生长时期、不同组织部位以及不同培养条件下，始终稳定表达的内参基因是不存在的[4]。因此，实时荧光定量PCR中内参基因的筛选和稳定性评价至关重要。目前，已有不少关于植物内参基因筛选评价的研究报道。如小麦(Triticumaestivum)[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、玉米(Zeamays)[7]、大豆(Glycinemax)[8]、茶树(Camelliasinensis)[9-10]、刺槐(Robiniapseudoacacia)[11]、苹果(Malusdomestica)[12]、松叶猪毛菜(Salsolalaricifolia)[13]、大针茅(Stipagrandis)[14-15]等。

羊草(Leymuschinensis)又名碱草，为禾本科多年生C3草本植物，是生长在欧亚大陆草原的一种优质牧草，具有抗寒、抗旱、耐盐碱等特性。目前，有关羊草的研究报道有很多，但主要集中在放牧利用[16]、功能性状[17]以及生理生化处理[18]等方面，还没有任何关于羊草实时荧光定量PCR内参基因筛选的报道。本研究选取8个候选内参基因，包括α-微管蛋白基因TUA、β-微管蛋白基因TUB、核糖体18SrRNA、转录延伸因子EF-1α、腺嘌呤磷酸核糖转化酶基因APRT、亲环蛋白基因CYP、肌动蛋白基因Actin、类胡萝卜素结合蛋白基因CBP20；采用qRT-PCR技术，结合geNorm 和NormFinder软件对候选的8个内参基因在羊草不同组织间的表达稳定性进行评价，以期筛选出在羊草各组织相对稳定表达的内参基因，为羊草研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料处理

本试验选用“吉生4号”羊草种子，先用5%次氯酸钠对种子进行消毒处理，后用无菌水冲洗干净，种植在20 cm (高)×16 cm(内径)花盆中，在恒温培养箱(Percival、美国)中进行25 ℃，16 h光照、8 h黑暗培养，正常浇水管理。待生长至抽穗期，选取生长良好的羊草，取不同生长器官(根、茎、叶、穗)，用蒸馏水清洗并擦干，锡纸包裹，液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。每组样品设3个生物学重复。

1.2 试验方法

1.2.1 羊草总RNA的提取及cDNA的合成 取100 mg羊草不同组织样品，置于研钵中，液氮条件下充分研磨，使用Trizol法提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测核酸质量。取1 μg总RNA，使用Prime ScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)反转录羊草cDNA第一链，并将合成的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 内参基因的定量PCR引物设计 本研究选取了8个常见内参(TUA、TUB、18SrRNA、EF-1α、APRT、CYP、Actin和CBP20)作为羊草的候选内参基因，其中，Actin序列来源于GenBank(HM623326.1)，其它7个基因均为农业部牧草资源与利用重点实验室自行扩增,由华大生物技术有限公司测序所得，尚未登录信息。利用PerlPrimer v.1.1.21软件，结合qRT-PCR引物设计原则设计各内参基因的qPCR引物。所有引物由华大生物技术有限公司合成(表1)。

1.2.3 内参基因的普通PCR扩增 PCR扩增反应体系为20 μL，包括10 μL 2×Taq Master Mix(康为世纪)，10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL，0.5 μL cDNA和7.5 μL RNase-Free Water。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸2 min。最后用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增产物。

1.2.4 内参基因的荧光定量PCR分析 qRT-PCR反应体系为20.0 μL：SYBR®Select Master Mix(2×) 10.0 μL，上、下游引物(10 mol·L-1)各0.4 μL， cDNA模板1 μL，8.2μL ddH2O，每个样品技术重复3次。反应在Applied Biosystems StepOnePlusTM实时定量PCR仪(USA)上进行，qRT-PCR反应程序参照试剂盒说明书，95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环；扩增结束后，在95 ℃获取熔解曲线，通过分析熔解曲线来确定扩增产物特异性。

表1 8个内参基因的定量PCR引物Table 1 Primers used for 8 reference genes in qRT-PCR

1.3 数据分析

使用geNorm和NormFinder软件，对8个常用内参基因在羊草不同组织器官的表达稳定性进行统计学分析。geNorm软件是通过分析内参基因在不同试验样品中的表达稳定性值(expression stability value，M)来确定内参基因稳定性的，其中，M值越小,表示基因表达越稳定；反之，M值越大,则基因表达越不稳定[19]。NormFinder软件通过计算不同试验样品各内参基因的表达稳定值(stability value，SV)来确定最优的内参基因，SV值越小表示该基因表达越稳定[19]。

2 结果与分析

2.1 样品总RNA提取与质量检测

羊草各组织样品总RNA的提取采用Trizol法，将提取得各组织总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，所提取的样品总RNA谱带清晰，较为完整(图1)。用NanoDrop2000c检测总RNA，其A260/A280均在1.8～2.1，A230/A260在2.0左右。以上检测结果证实所提取羊草样品总RNA完整性好，纯度高，可进行反转录合成cDNA。

2.2 内参基因引物特异性分析

使用羊草叶片总RNA反转录cDNA为模板进行PCR扩增，得到的扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到的扩增基因片段特异性良好，片段大小也和预测的结果一致(图2)。再分别以羊草叶、茎、根和穗4种组织样品的cDNA为模板进行qRT-PCR检测，所有基因均得到明显的单峰熔解曲线，扩增曲线重复性较好，说明各内参基因产物特异性好，不存在引物二聚体，因此证实qRT-PCR的检测结果准确。

图1 羊草不同组织样品总RNA电泳结果Fig. 1 Electrophoresis of total RNA from different tissues of Leymus chinensis

图2 8个内参基因的PCR产物Fig. 2 PCR produces of 8 reference genes

2.3 内参基因的Ct值分析

在qRT-PCR中，基因Ct值(Cycle threshold，循环阈值)的大小反映其表达量，即Ct值越大，基因表达量越低；Ct值越小，基因表达量越高。本研究中8个内参基因Ct值都处于10(18SrRNA)至28(TUB)之间，其中TUB的Ct值最大，在24～30；18SrRNA的Ct值最小，在10～13；TUA、CYP和Actin的Ct值均在20～25；APRT、EF-1α和CBP20的Ct值均处于23～27(图3)。该结果表明，8个内参基因的表达量存在差异。

图3 8个内参基因Ct值分布图Fig. 3 Ct values of 8 reference genes

2.4 内参基因表达稳定性分析

2.4.1 geNorm软件分析 经geNorm软件分析，比较各基因在不同样品所得表达稳定性(M)值，结果发现以羊草各组织为试验材料，其内参基因表达稳定性存在明显差异。其中，8个内参基因表达在羊草叶、茎、根和穗中稳定性由高到底排序分别为(图4)CYP=TUA>Actin>18SrRNA>APRT>EF-1α>TUB>CBP20；EF-1α=APRT>18SrRNA>TUB>TUA>Actin>CBP20>CYP；CYP=APRT>18SrRNA>TUB>TUA>EF-1α>Actin>CBP20；APRT=Actin>TUB>CYP>CBP20>EF-1α>18SrRNA>TUA。即在羊草叶片表达最稳定的内参基因是CYP和TUA、最不稳定的内参基因是CBP20；在茎中表达最稳定的内参基因是EF-1a和APRT，最不稳定的内参基因是CYP；在根部表达最稳定的内参基因是CYP和APRT，最不稳定的内参基因是CBP20；在穗中表达最稳定的内参基因是APRT和Actin，最不稳定的内参基因是TUA。

2.4.2 NormFinder软件分析 利用NormFinder软件将所有处理的样品进行内参基因表达分析，通过比较各内参基因的表达稳定值，得到的结果如表2所示：在羊草叶、茎、根和穗4种组织中，8个内参基因表达稳定性由高到底排序分别为APRT=18SrRNA>Actin>EF-1α>CYP>TUA>TUB>CBP20；EF-1α=APRT>18SrRNA>TUB>TUA>CBP20>Actin>CYP；TUB>18SrRNA>APRT>CYP=EF-1α>TUA>Actin>CBP20；CYP>TUB>CBP20>Actin>APRT>EF-1α>18SrRNA>TUA。即在羊草叶片表达最稳定的内参基因是APRT和18SrRNA；在羊草茎中表达最稳定的内参基因是EF-1a和APRT；在羊草根部表达最稳定的内参基因是TUB，其次是18SrRNA和APRT；在羊草穗中表达最稳定的内参基因是CYP，其次是TUB、CBP20。

图4 geNorm软件评价内参基因表达稳定值Fig. 4 Expression stability values of the reference genes evaluated by geNorm

表2 羊草不同组织器官中8个内参基因稳定性的NormFinder分析Table 2 Analysis of the stabilities of 8 reference genes in different tissues value of Leymus chinensis by NormFinder

2.5 羊草各组织中最佳内参基因的选择

综合比较geNorm和NormFinder两种软件对羊草叶片、茎、根和穗中8个候选内参基因表达稳定性评估结果(表3)，发现geNorm和NormFinder的评价结果存在差异，导致内参基因的稳定性排序不一致。但表达稳定性排名前三的基因存在部分重叠，故选择重叠基因作为每个组织的最佳管家基因。在叶片中选择Actin作为内参基因；在茎中选择EF-1a作为内参基因；在根中选择APRT和18SrRNA作为内参基因；在穗中选择TUB作为内参基因。

3 讨论与结论

近年来大量研究发现，内参基因稳定性根据环境和品种不同而变化，稳定内参基因的选择是基因表达定量分析的关键因素。目前，国内外关于内参基因筛选的报道有很多[20-24]。最初，Actin被认为是在植物各个生长时期及各组织部位均稳定表达的内参基因[25]。在茶树[9]和刺槐[11]的不同组织定量PCR稳定内参筛选中，Actin基因表达最稳定。在杨树(Populus)叶片与根系中Actin也是表达最稳定的内参基因[26]。Actin基因在盐生草(Halogetonglomeratus)材料中高度保守且表达量恒定，可作为内参[27]。

表3 8个内参基因表达稳定性geNorm和NormFinder比较Table 3 Comparison of expression stability of 8 reference genes generated by geNorm and NormFinder

有研究证明，常用的传统内参基因也会出现表达不稳定的情况。如在矮牵牛(Petuniahybrida)叶与花组织研究中，Actin基因表达不够稳定，EF-1a和CYP被确定为最佳内参基因组合[24]。在白菜(Brassicarapassp.pekinensis)[28]、黄瓜(Cucumissativus)[29]内参筛选中，EF-1a基因也被证实表达最稳定。该基因在小麦不同组织[3]以及在茶树不同成熟叶片[9]中均表现出较高的表达稳定性。这说明EF-1a基因在某些组织研究中比Actin基因更适合选作内参基因。由此可见，在实际研究中各内参基因均在特定的生长时期、组织或条件下相对表达稳定。从本研究对羊草不同组织中8个常用内参基因的表达分析可以看出，并没有一个基因在所有组织中都稳定表达。EF-1a在羊草茎组织表达最稳定；而Actin基因在羊草叶片组织中表达较稳定，在其它组织中表达稳定性不是最佳。同样，18SrRNA基因在羊草根、茎组织中表达相对稳定，但在羊草穗中表达稳定性较差。有研究认为，在qRT-PCR检测中，18SrRNA的目标mRNA转录丰度不精确，故18SrRNA基因不可作为内参基因[13]。

本研究中，选用两个不同的内参稳定性评价软件分析得到的结果存在差异，导致内参基因的稳定性排序不一致。该现象在其它研究中也有存在，如在大豆[30]，柑橘(Citrusreticulata)[31]，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[32]等内参基因的研究中，均出现类似结果，推测可能是分析软件的统计学原理不同造成了这种差异[30]。综合数据分析，虽然评价结果存在差异，但表达稳定性较高的基因存在部分重叠，故选择重叠基因作为每个组织的最佳管家基因。即在羊草叶片组织中，Actin基因表达相对稳定；茎组织中，EF-1a基因表达最稳定；根系组织中，APRT和18SrRNA基因表达相对稳定；而在穗组织中，基因TUB表达较稳定。本研究结果将为开展羊草功能基因的表达分析提供参考。

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(责任编辑 王芳)

Selection of reference genes for quantitative real-time PCR ofLeymuschinensisin different tissues

Hu Ning-ning1,2, Guo Hui-qin3, Li Xi-liang1, Kong Ling-qi1, Wu Zi-nian1, Zhang Ji-ze1, Chang Chun1, Wan Dong-li1, Zang Hui1,2, Ren Wei-bo1
(1. Grassland Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hohhot 010010, China; 2.Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China; 3.College of Life Science Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

To explore the optimal reference genes in different tissues ofLeymuschinensisfor a quantitative real-time PCR experiment, eight general housekeeping genes includingTUA,TUB, 18SrRNA,EF-1α,APRT,CYP,ActinandCBP20 were selected as candidate reference genes. Using roots, stems, leaves, and spikes ofL.chinensis, we analyzed the 8 candidate reference gene expressions using qRT-PCR and evaluated their expression stability using geNorm and NormFinder software. The results showed that stability differed significantly among the eight candidate reference genes in different tissues. The most stable reference gene wasActinin leaves,EF-1ain stems,APRTand 18SrRNAin root andTUBin spikes. The present study has provided an important reference for analysis the expression of functional genes inL.chinensis.

Leymuschinensis; qRT-PCR; reference gene; tissue

Ren Wei-bo E-mail:rppcaucau@163.com

2016-10-08 接受日期：2016-12-12

国家重点基础研究计划973项目(2014CB138804)；国家自然科学基金(31502008)；中央级公益性科研院所基本科研业务费

胡宁宁(1991-)，女，陕西榆林人，在读硕士生，主要从事羊草功能基因研究。E-mail：huningning317@163.com

任卫波(1979-)，男，山西晋城人，副研究员，博士，主要从事牧草分子生物学研究。E-mail：rppcaucau@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0510

S543+.9;Q943.2

A

1001-0629(2017)07-1434-08

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