侯卫坤，王 博，刘 林，许 鹏*

(1西安交通大学医学部附属红会医院关节病医院骨坏死与关节重建病区，西安 710054；2西安交通大学第一附属医院转化医学中心；*通讯作者，E-mail：sousou369@163.com)



IL-22促进滑膜细胞表达MMP3、VEGF而抑制MMP13的表达

侯卫坤1，王 博2，刘 林1，许 鹏1*

(1西安交通大学医学部附属红会医院关节病医院骨坏死与关节重建病区，西安 710054；2西安交通大学第一附属医院转化医学中心；*通讯作者，E-mail：sousou369@163.com)

目的 观察IL-22在体外对滑膜成纤维细胞MMP3、MMP13及VEGF表达的影响。 方法 纳入2012-03～2012-06在西安市红会医院接受全膝关节置换术的患者，分为类风湿性关节炎(RA)及骨性关节炎(OA)两组，每组各8例患者；用实时定量PCR检测膝关节滑膜组织IL-17、IL-22、IL-17RA、IL-22R1、IL-22BP、AHR、MMP3及MMP13等基因mRNA水平的表达。体外培养滑膜细胞系HTB-93，分为对照组、IL-22组及IL-22+IL-22BP组，实时定量PCR检测MMP3、MMP13及VEGF基因mRNA水平的表达变化。结果采用Mann-WhitneyU检验统计数据。 结果 在OA滑膜组织中，IL-22、IL-22R1、AHR以及MMP13 mRNA表达水平较在RA滑膜组织中高(P<0.05)，而IL-17RA及MMP3则相反，在RA滑膜组织中表达较高(P<0.05)。体外培养HTB-93滑膜细胞系上，与对照组相比，IL-22组MMP3和VEGF的mRNA表达上调(P<0.05)，而MMP13的mRNA表达下调(P<0.05)；与IL-22组相比，IL-22+IL-22BP组的MMP3和VEGF的mRNA表达有下调趋势，而MMP13的mRNA表达有上调趋势，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 IL-22在OA滑膜组织中的表达较高，在体外可促进滑膜细胞表达MMP3、VEGF而抑制MMP13的表达。

骨性关节炎； 类风湿性关节炎； IL-22； 滑膜细胞； MMP； VEGF

IL-22是Th22型细胞分泌的代表性细胞因子，其通过与特异性的IL-22R1结合发挥作用，在机体内存在IL-22的可溶性受体IL-22BP，对IL-22的信号转导起抑制作用。IL-22在多种自身免疫性疾病中发挥作用，本课题的前期研究发现IL-22在关节炎的慢性期表达显著增高(未发表)，然而，其在滑膜炎发病中的作用尚不明确。

类风湿性关节炎(RA)和骨性关节炎(OA)是两种不同类型的关节炎，均可表现出滑膜炎。RA为一种慢性免疫炎性疾病，滑膜炎是其主要病理改变，活化的T细胞在RA发病过程中起着重要作用[1,2]。OA的特征性病理改变是关节软骨的进行性退变和继发性骨质增生[3]，关节滑膜也可出现一定的增生和淋巴细胞浸润，是导致中老年人残疾的主要疾病之一[4,5]。

为进一步明确IL-22对滑膜炎的作用，本研究比较两种疾病滑膜组织中IL-22相关基因表达谱的改变，进一步在体外观察IL-22对滑膜细胞的功能影响。

1 材料与方法

1.1 RA和OA患者滑膜标本收集

本实验研究对象RA和OA患者各8例，为2012-03～2012-06西安市红会医院住院接受全膝关节置换术的患者。根据病史、查体和X线片等资料，参照美国风湿病学会(1986)推荐的膝关节RA和OA诊断标准进行诊断[6]。排除标准为合并严重心肺功能不良、肺炎、泌尿系感染，术前服用激素、免疫抑制剂等。在进行膝关节置换手术时，切下的滑膜先除净附着的脂肪组织后转移到-80 ℃低温冰箱冻存。所有研究对象填写了书面知情同意书。本研究经西安市红会医院伦理委员会审查通过。

1.2 细胞株、主要试剂和仪器

HTB-93(滑膜细胞株)购自美国ATCC细胞库，IL-22(美国Peprotech公司)，IL-22BP(美国R&D Sytems公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒(加拿大Fermentas公司)，SYBR green荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)，PCR引物合成(上海生工)，DMEM培养基(美国Gibco)，胎牛血清(杭州四季青)，微量核酸/蛋白定量仪(Cecil仪器公司，型号CE 2301)，实时定量PCR仪(iQ5，美国Bio-Rad公司)，全波长酶标仪(美国Thermo公司)。

1.3 研究方法

将患者滑膜组织中的RNA提取，采用实时定量PCR检测IL-17、IL-22、IL-17RA、IL-22R1、IL-22BP、AHR、MMP3及MMP13等基因mRNA的表达；进行HTB-93细胞培养，观察IL-22对滑膜细胞增殖的影响，再用实时定量PCR检测MMP3、MMP13及VEGF等基因mRNA的表达。

1.4 RNA提取、定量和鉴定、逆转录cDNA及实时定量PCR

滑膜组织及细胞的总RNA采用Trizol的方法提取。将得到总RNA在微量核酸/蛋白定量仪上定量，测OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。总RNA采过琼脂糖凝胶电泳的方法进行鉴定，观察28S、18S条带清晰完整，两个条带灰度的比值是否接近2 ∶1，提取RNA的质量良好。按照生厂商(加拿大Fermentas公司)的说明书，mRNA首先逆转录合成cDNA第一链。先用纯水将cDNA稀释8倍；在200 μl的PCR 8连管中加入4 μl cDNA模板、5 μl 2×SYBR Green Ⅱ Supermix以及上下游引物各0.5 μl；混匀、离心；在实时定量PCR仪上检测IL-17、IL-22、IL-22R1、IL-22BP、AHR、MMP3、MMP13及VEGF等基因mRNA水平的表达。反应条件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，退火温度20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。所用引物和退火温度见表1，内参照选用β-actin，基因表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.5 细胞培养及实验分组

体外培养HTB-93细胞，培养基为DMEM高糖培养基+10%胎牛血清，在37 ℃ 5% CO2培养箱培养。在6孔板中接种细胞的数量为每孔30×104个细胞；接种后24 h进行干预实验。实验分组为：对照组(每孔加入2 ml PBS)，IL-22组(每孔加入2 ml含10 ng/ml IL-22的培养基)，IL-22+IL-22BP组(每孔加入2 ml含10 ng/ml IL-22及10 ng/ml IL-22BP的培养基)，每组均有3个复孔；培养48 h收获细胞。

表1 实时定量PCR引物信息

Table 1 Sequences of real time PCR primers

引物序列(5'-3')扩增长度(bp)退火温度(℃)hIL-17Sense:GACTCCTGGGAAGACCTCATTGGAntisense:CTTGTCCTCAGAATTTGGGCATCC11554hIL-22Sense:CCTATATCACCAACCGCACCTTCAntisense:AGATTGAGGGAACAGCACTTCTTC17653hIL-17RASense:GTGAGCACGCCAGGATGAAGAntisense:TTGGATCGCTGGTGGAACTC23158hIL-22R1Sense:TCCAGCCTCACCACTCACAAGAntisense:TTCATTTCATCTTCACCACAACTCC13061hIL-22BPSense:CAGTGGGTAGCAGGAGAAGGACAntisense:GGAGAGGCAGTGAGCAGGAG19753hAHRSense:CTAACAGATGAGGAAGGAACAGAGCAntisense:AGAGTGGATGTGGTAGCAGAGTC18264hMMP3Sense:AACAATGGACAAAGGATACAACAGGAntisense:CATCTTGAGACAGGCGGAACC16264hMMP13Sense:CAGTGGTGGTGATGAAGATGATTTGAntisense:TCTAAGGTGTTATCGTCAAGTTTGC19764hVEGFSense:CTACCTCCACCATGCCAAGTAntisense:TCTCTCCTATGTGCTGGCCT31158hβ-actinSense:ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG17961

1.6 细胞增殖检测

MTT法通过读取OD490值而反映细胞活力，而细胞活力与细胞数呈正相关，本研究通过MTT法检测IL-22对滑膜细胞增殖的影响，按照加入IL-22的不同浓度进行分组。96孔板中每孔接种2×104个MTB-93细胞；接种第2天细胞完全贴壁后，每孔加入含不同浓度IL-22(5，10，20，40 ng/ml)的培养基200 μl，每个浓度都有6个复孔；24 h或48 h再加入MTT 20 μl(5 mg/ml)，继续在37 ℃ 5% CO2培养箱孵育4 h；小心弃去培养基，再加入150 μl DMSO，在微量振荡器上充分振荡10 min，使结晶物完全溶解；在全波长酶标仪上读取OD490值。

1.7 统计学分析

所有的实验数据均采用SPSS15.0统计软件进行统计，数据分布不符合正态分布，采用Mann-WhitneyU非参数检验统计；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA与OA滑膜组织中细胞因子mRNA的表达

在OA滑膜组织中，IL-22、AHR以及MMP13 mRNA表达水平较在RA滑膜组织中高(P<0.05)，而IL-17RA及MMP3则相反，在RA滑膜组织中表达较高(P<0.05)。IL-22R1在OA滑膜组织的表达水平较在RA滑膜组织中的表达水平有增高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，而IL-22BP相反，在RA滑膜组织中的表达水平有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，二者的比值IL-22R1/IL-22BP在OA中显著高于RA滑膜组织中(P<0.05)。IL-17在两组之间的表达无统计学差异(P>0.05,见图1)。

2.2 IL-22对滑膜细胞表达MMP3、MMP13及VEGF的影响

体外培养滑膜细胞系HTB-93，观察不同浓度IL-22分别刺激24 h 或48 h对细胞增殖的影响，结果发现5,10,20,40 ng/ml浓度都对HTB-93细胞的增殖无明显影响(P>0.05，见图2A,2B)。在滑膜细胞系HTB-93上，与对照组相比，IL-22组MMP3和VEGF的mRNA表达上调(P<0.05)，而MMP13的mRNA表达下调(P<0.05)；同IL-22组相比，IL-22+IL-22BP组的MMP3和VEGF的mRNA表达有下调趋势，而MMP13的mRNA表达有上调趋势，但差异无统计学意义(P>0.05，见图2C-E)。

与OA比较,*P<0.05图1 OA与RA患者膝关节滑膜组织中相关基因的mRNA表达Figure 1 Comparison of related gene mRNA expression in synovial tissues between OA and RA patients

A，B.MTT法检测不同浓度IL-22对HTB-93细胞增殖的影响，分别观察了作用24 h(A)和48 h(B)两个时间点；C-E.10 ng/ml IL-22单独刺激或者10 ng/ml IL-22+10 ng/ml IL-22BP联合作用于HTB-93细胞系48 h后MMP3(C)、MMP13(D)以及VEGF(E)mRNA的表达改变;与对照组(Ctrl)比较，*P<0.05图2 IL-22对滑膜增殖及表达MMP3、MMP13和VEGF的影响Figure 2 Effect of IL-22 on synovial proliferation and expression of MMP3,MMP13 and VEGF

3 讨论

IL-22与RA发病关系尚不明确。在RA患者血浆中IL-22表达水平较正常高，的滑膜组织中IL-22及IL-22R1的mRNA均显著上调，而IL-22阳性细胞既有A型滑膜细胞，也有B型滑膜细胞；IL-22R1主要表达在B型滑膜细胞上[7]。在CIA小鼠模型上，也发现血清中IL-22的表达较正常对照组显著升高，而IL-22-/-小鼠CIA的发病率及发病程度均显著下降，其滑膜组织中的促炎因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)和MMP9的mRNA表达也下降[8]。

MMP是一大类降解细胞外基质的蛋白酶，它们在组织降解、修复等过程中起着重要作用。MMP3又叫间质溶解素1，可降解纤连蛋白、层粘连蛋白、Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ、Ⅹ型胶原以及软骨蛋白聚糖；MMP13也称为胶原酶Ⅲ，可特异性的降解CⅡ、也可降解Ⅰ和Ⅲ型胶原，在关节软骨转换和OA的病理改变中其重要作用。MMP3与局部细胞的迁移有关，而MMP13可能与软骨内成骨过程相关[9]。

在皮肤损伤修复的研究中发现，IL-22可刺激角质形成细胞分泌MMP3，并且使角质形成细胞的迁移性增加，从而加速组织愈合[10，11]。本研究结果显示IL-22可促进滑膜细胞表达MMP3，与皮肤组织中的研究结果一致，提示IL-22可能在关节滑膜组织的修复过程中起作用。然而，本研究的结果发现IL-22抑制MMP13的表达。可能的原因如下：首先，MMP3和MMP13的调节方式不尽相同。MMP3和MMP13的启动子区均有AP-1的结合位点，因此，IL-1和TNF-α通过激活MAPK通路调节AP-1的表达，进而促进MMP3和MMP13的表达；激活MMP3的另一途径是NF-κB，在MMP3的启动子区有它的结合区域，而MMP13的启动子区则无[12]。已有资料表明，STAT通路也参与MMPs基因的表达，在皮肤损伤修复以及肿瘤侵袭和转移中起着调节作用[13,14]。由于IL-22主要激活JAK-STAT，因此，IL-22对MMP3和MMP13的调节作用不同可能是由此造成的。然而在RA和OA患者滑膜中的检测结果为IL-22与MMP13的表达呈正相关，而与MMP3负相关。提示，体内除了IL-22以外，还有其他因素参与了MMPs的调节。其次，在正常关节组织，MMP3主要表达于滑膜细胞，而MMP13主要在软骨细胞高表达。因此，IL-22对MMP13的作用还需要进一步在软骨细胞上核实。IL-22可能通过调节滑膜细胞分泌MMP3而降解基质。

在RA发病过程中，血管翳的生成是引起关节软骨和软骨下骨破坏、关节粘连及后期的关节强直的最关键因素。由于血管翳可释放出一些水解酶和细胞因子，加剧胶原基质的降解，最终逐步侵蚀关节软骨和软骨下骨，导致关节重塑。而VEGF是在血管生成过程中其重要作用的因子。本研究的结果发现正常滑膜细胞不表达VEGF，而IL-22可刺激滑膜细胞产生VEGF，并且其作用可被IL-22BP抑制。该结果提示，IL-22可能也参与了血管生成的调节过程。

总之，IL-22使关节滑膜细胞分泌MMPs，从而促进关节软骨及细胞外基质的降解；也可促使滑膜细胞表达VEGF，参与血管生成的调节。

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IL-22 promotes MMP3 and VEGF and suppresses the expression of MMP13 in synovial cells

HOU Weikun1,WANG Bo2，LIU Lin1，XU Peng1*

(1OsteonecrosisandJointReconstructionWard，DepartmentofJointSurgery，HonghuiHospital，Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter，Xi’an710054，China；2CenterforTranslationalMedicine，FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor，E-mail:sousou369@163.com)

ObjectiveTo explore the influence of IL-22 on expression of MMP3，MMP13 and VEGF gene in synovial cellsinvitro.MethodsFrom March 2012 to June 2012，16 patients undergoing total knee arthroplasty in Xi’an Honghui Hospital，8 patients with OA and 8 patients with RA，were recruited.Real-time quantitative PCR was used to detect mRNA expression levels of IL-17，IL-22，IL-17RA，IL-22R1，IL-22BP，AHR，MMP3 and MMP13 in synovial tissues.The synovitial cell line HTB-93 wereinvitrocultured，and divided into control group，IL-22 group and IL-22+IL-22BP group.Then mRNA expression levels of MMP3，MMP13 and VEGF were detected by real-time quantitative PCR.Mann-WhitneyUtest was used to analyze the data.ResultsThe mRNA expression levels of IL-22，IL-22R1，AHR and MMP13 were higher in synovial tissues of OA patients than those of RA(P<0.05)，while the expression of IL-17RA and MMP3 was lower(P<0.05).Invitro，the mRNA expression levels of MMP3 and VEGF were higher in IL-22 group than in control group(P<0.05)，while the expression of MMP13 was lower(P<0.05).Compared with IL-22 group，the mRNA expression levels of MMP3 and VEGF decreased while the expression of MMP13 increased in IL-22+IL-22BP group,but there was no statistical significance(P>0.05).ConclusionThe mRNA expression of IL-22 is higher in synovial tissues of OA patients than that of RA patients.IL-22 may promote the expression of MMP3 and VEGF，and suppress the expression of MMP13 in synovial cells in vitro.

osteoarthritis; rheumatoid arthritis; IL-22; synovial cells; MMP; VEGF

国家自然科学青年基金资助项目(81201373)；陕西省博士后科研基金资助项目(2016BSHEDZZ93)

侯卫坤，男，1983-07生，博士，主治医师，E-mail：weikunhou@163.com

2016-06-03

R684.3

A

1007-6611(2017)04-0343-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.009