宁映霞，董巍檑，陈 阿，许 畅，崔迎红，李 翔

（1.广州医科大学附属第一医院，广州 510120；2. 南华大学第一附属医院，衡阳 421001；3. 湖南师范大学医学院，长沙 410013）

DFOG对卵巢癌OVCAR3源性球细胞迁移和Tw ist1/FoxM 1表达的影响

宁映霞1，董巍檑2，陈 阿3，许 畅3，崔迎红3，李 翔3

（1.广州医科大学附属第一医院，广州 510120；2. 南华大学第一附属医院，衡阳 421001；3. 湖南师范大学医学院，长沙 410013）

目的：检查金雀异黄素（genistein，GEN）及其新型合成类似物7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀异黄素（7-difluoromethoxyl-5，4'-di-n-octyl genistein，DFOG）对人卵巢癌OVCAR3源性球细胞迁移和Twist1/ FoxM1蛋白表达的作用。方法：Transwell小室细胞迁移试验检测细胞迁移率。蛋白质印迹分析细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平。结果：与OVCAR3细胞相比，OVCAR3源性球细胞迁移率更高。GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球细胞迁移。此外，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）平行地下调Twist1和FoxM1蛋白表达。结论：GEN及其类似物DFOG抑制OVCAR3源性球细胞体外迁移与其抑制Twist1和FoxM1蛋白表达相关。

金雀异黄素；7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀异黄素；卵巢癌；卵巢癌干细胞样细胞；细胞迁移

越来越多的证据表明肿瘤干细胞是恶性肿瘤复发、转移的主要原因，而现有的治疗手段无法针对肿瘤干细胞这一导致肿瘤治疗失败、复发和转移的原因性细胞［1］。我们先前的研究表明，5，4’-二-正辛烷氧基-7-二氟甲氧基金雀异黄素（7-difluoromethyl-5，4’-di-n-octylgenistein，DFOG）抑制具卵巢干细胞样细胞特性的SKOV 3和A 2780源性球细胞自我更新能力［2，3］。本文的研究目的在于确定金雀异黄素（genistein，GEN）及其新型合成类似物DFOG能否抑制人卵巢癌OVCAR3源性球细胞迁移和调控Twist1及FoxM1蛋白表达。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂DFOG（分子量：544，性状：黄色粉末，纯度：98%）参照文献［4］方法合成和结构确证，由湖南师范大学曹建国教授惠赠。金雀异黄素（Sigma-Aldrich公司）。鼠抗人β-actin单克隆抗体源自美国Santa Cruz Biotechnology，Inc.公司；兔抗人Twist1多克隆抗体源自美国Abcam，Inc. 公司；鼠抗人FOXM1抗体（K-19）（美国Santa Cruz Biotechnology 公司）；增强化学发光检测试剂购自美国Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.2 细胞培养与球培养人卵巢癌细胞系OVCAR3购自中国科学院细胞中心（中国上海市）。参照文献［2，3］描述的方法和步骤，完成细胞培养和肿瘤球培养，取OVCAR3细胞系第2代球细胞作为OVCAR3源性球细胞。

1.3 Transwell小室迁移试验取带Transwell嵌合小室（8 μm孔径聚碳酸酯膜）6孔培养板（美国corning公司），每孔加入1.0mL完全干细胞条件培养基作为趋化试剂（下室）；然后，放置嵌合小室，用无生长因子干细胞条件培养基悬浮细胞，每嵌合小室（上室）接种5000个细胞；培养24 h，用棉签清除未迁移的细胞；用甲醇固定下室面膜上的迁移细胞，并进行HE染色。在光学显微镜下，计数每孔通过膜迁移的细胞数，以OVCAR3细胞或溶媒（0.1% DMSO）处理OVCAR3源性球细胞为100%标化细胞迁移率。

1.4 蛋白质印迹参照先前发表文献［5，6］的方法和步骤完成蛋白质印迹分析。

1.5 统计学分析各组实验数据录入Spss 20.0 for windows evaluation 软件建立数据库，用均数±标准差（±sD）表示，采用One Way ANOVA方差分析；方差齐性检验，在方差齐性时，多组均数间比较采用LSD法，在方差不齐时，多组均数间采用Tukey's检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 OVCAR3细胞与OVCAR3源性球细胞体外迁移能力的比较与OVCAR3细胞相比，OVCAR3源性球细胞迁移率显著地增高（P＜0.05；图1）。

2.2 OVCAR3细胞与OVCAR3源性球细胞Tw ist1和FoxM 1蛋白表达的比较与OVCAR3细胞相比，OVCAR3源性球细胞Twist1和FoxM1蛋白表达明显上调（图2）。

2.3 DFOG对OVCAR3源性球细胞迁移的影响与溶媒（0.1% DMSO）处理OVCAR3源性球细胞比较，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球细胞迁移（P＜0.05；图3）。

图1 OVCAR3源性球细胞展示出更高细胞迁移率（Mean±SD，n=3）OVCAR3：OVCAR3细胞；OCSLC：OVCAR3源性球细胞。OVCAR3细胞与OVCAR3细胞源性球细胞比较：*P＜0.05。

图2 OVCAR3源性球细胞高表达Twist1和FoxM1蛋白OVCAR3：OVCAR3细胞；OCSLC：OVCAR3源性球细胞。

图3 DFOG抑制OVCAR3源性球细胞迁移（Mean±SD，n=3）GEN（40.0 μM）或DFOG（5.0 μM和10.0 μM）处理OVCAR3源性球细胞与溶媒（0.1% DMSO）处理OVCAR3源性球细胞比较：*P＜0.05；DFOG（10.0 μM）处理OVCAR3源性球细胞与GEN（40.0 μM）或DFOG（5.0 μM）处理OVCAR3源性球细胞比较：#P＜0.05。

2.4 DFOG对OVCAR3源性球细胞Tw ist1和FoxM 1蛋白表达的影响图4可见，GEN（40.0 μM）能有效地抑制OVCAR3源性球细胞Twist1和FoxM1蛋白表达；DFOG（5.0 μM和10.0 μM）处理显著地下调OVCAR3源性球细胞Twist1和FoxM1蛋白表达。

图4 DFOG下调OVCAR3源性球细胞Twsit1和FoxM1蛋白表达

3 讨论

先前的实验研究结果证明，从建立人卵巢癌细胞系得到的球细胞具有自我更新能力和上皮-间充质转化表型［2，3，5，6］。本文采用Transwell小室细胞迁移试验检测的结果表明，与OVCAR3细胞相比，OVCAR3源性球细胞具有更高体外细胞迁移能力。从而说明更强体外细胞迁移能力是一种卵巢癌干细胞样细胞的功能特性。

我们曾报道金雀异黄素类似物DFOG抑制从建立人卵巢癌细胞系得到的卵巢癌干细胞样细胞肿瘤球形成［2，5，6］。本文实验发现，与溶媒（0.1% DMSO）处理OVCAR3源性球细胞比较，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球细胞迁移。

Twist是一种高度保守的碱性-螺旋-环-螺旋转录因子，在胚胎发育中促进细胞运动方面起重要作用［7］。肿瘤细胞中，Twist被视为癌基因，因为其表达增加可通过诱导上皮-间充质转化（EMT）而促进疾病进程和转移［8］。本文的实验结果显示，OVCAR3源性球细胞展示出更高Twist1蛋白表达水平。

我们先前发表文章指出，DFOG抑制SKOV3源性卵巢癌干细胞样细胞自我更新与下调FoxM1蛋白表达相关［5］。Chen PM等研究建议FoxM1-MMP2信号轴活化促进肺癌细胞侵袭［9］。Qian J等的研究表明Twist1上调FoxM1促进胃癌细胞增殖［10］。在本文的研究中，我们发现OVCAR3源性球细胞过表达FoxM1蛋白。

值得注意的是，在本文的研究中，我们证实GEN及其新型合成类似物DFOG明显下调OVCAR3源性球细胞Twist1和FoxM1蛋白表达。 总结上述实验研究结果，我们有理由提出如下建议：（1）OVCAR3源性球细胞更强细胞迁移能力可能与Twist1和FoxM1蛋白过表达有关；（2）GEN及其新型合成类似物DFOG抑制OVCAR3源性球细胞作用与其下调Twist1和FoxM1蛋白表达相关。

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［2］ 宁映霞, 曹建国.7-二氟甲氧基-5, 4'-二正辛烷氧基金雀异黄素对卵巢癌干细胞样细胞自我更新和FoxM1表达的影响［J］. 湖南师范大学学报 (医学版), 2014, (01): 10-13.

［3］ 宁映霞, 邓宇傲, 曹建国. DFOG抑制卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新与活化FoxO3a相关［J］. 湖南师范大学学报 (医学版), 2014, (02): 1-4.

［4］ Xiang HL, Liu F, Quan MF, Cao JG, Lv Y.7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein inhibits growth of gastric cancer cells through down-regulating forkhead box M1［J］. World J Gastroenterol.2012, 18(33): 4618-4626.

［5］ Ning Y, Luo C, Ren K, Quan M, Cao J. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein［J］. Mol Med Rep.2014, 9(5): 1982-1988.

［6］ Ning YX, Li QX, Ren KQ, Quan MF, Cao JG.7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1［J］. Oncol Lett.2014, 8(1): 295-300.

［7］ Li J, Zhou BP. Activation of β-catenin and Akt pathways by Twist are critical for the maintenance of EMT associated cancer stem cell-like characters［J］. BMC Cancer.2011, 11: 49.

［8］ Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN. IL-6 stabilizes Twist and enhances tumor cell motility in head and neck cancer cells through activation of casein kinase 2［J］. PLoS One.2011, 6(4): e19412.

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［10］ Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X. Twist1 Promotes Gastric Cancer Cell Proliferation through Up-Regulation of FoxM1［J］. PLoS One.2013, 8(10): e77625.

Effects of DFOG on M igration and Expression of Tw ist1/FoxM 1 in Human Ovarian Cancer OVCAR3-derived Spheroids

Ning Ying-Xia1, Dong Wei-Lei2, Chen A3, Xu Chang3, Cui Ying-Hong3, Li Xiang3
(1. Department of Gynaecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China; 2. Department of Gynaecology and Obstetrics, University of South China, Hengyang 421001, China; 3. Pharmaceutical Science, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

Objective To investigate the effects of genistein (GEN) and its novel synthetic analogue 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein (DFOG) on the cell migration and the expression of Twist1/FoxM1 in human ovarian cancer OVCAR3-derived spheroids. M ethods Cell migration ratio was detected using Transwell cell migration assay. The expression of Twist1 and FoxM1 was analyzed using western blot. Results Compared with OVCAR3 parent cells, cell migration ratio was higher in OVCAR3-derived spheroids. Moreover, both GEN (40μM) and DFOG (5μM and10μM) could inhibited the cell migration ratio in OVCAR3-derived spheroids. And they could also parallelly down-regulate the protein expression of Twist1 and FoxM1. Conclusion Cell migration inhibited by GEN and its analogue DFOG is associated with inhibiting the expression of Twsit1 and FoxM1 in OVCAR3-derived spheroids.

genistein; 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein; ovarian cancer; ovarian cancer stem-like cells; cell migration

R737.31

A

1673-016X（2017）04-0001-03

2017-01-03

国家自然青年基金 (No.81301894)；广东省科技计划项目 (No.2014A020211028)；广州市教育系统科研项目(No.1201410508)

董巍檑，E-mail：540325366@qq. com