周桂林+范家萌+周贤达+王兆贤+王浩波

摘 要：为加强两系超级稻丰两优四号的品种质量控制，打击假冒伪劣，该研究利用SSR分子标记技术构建丰两优四号的指纹图谱，筛选适用于该品种的SSR特征引物，并利用纯度SSR快速鉴定技术体系鉴定丰两优四号的纯度。结果表明：在48对标准SSR引物中，有19对引物在丰两优四号亲本间具有多态性，杂交种呈现双亲互补带型，可用于该品种纯度鉴定；利用SSR快速鉴定技术鉴定丰两优四号样品纯度的结果表明，引物RM224和RM336不仅能区分母本、父本混杂，还能鉴定多种串粉和机械混杂，是对丰两优四号纯度鉴定较为适宜的特征引物。

关键词：两系超级稻；丰两优四号；SSR；指纹图谱；纯度

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0138-04

Fingerprinting Construction and Rapid Purity Identification of a Two-line Super Rice Variety，

Fengliangyou 4

Zhou Guilin et al.

（Hefei Fengle Seed Co.，Ltd，Hefei 230000，China）

Abstract：To enhance the quality control and fight against counterfeit and defective seeds of a two-line super rice variety fengliangyou 4，fingerprinting map was constructed，and specific primers were screened and used to detect the purity of the sample.The results revealed that the parents of fengliangyou4 showed polymorphism at 19 of 48 SSR markers，and the hybrid's amplification bands were complementary with that of the parents，indicating that the 19 markers were available for purity identification of the hybrid；but RM224 and RM336 were more suitable，because they can distinguish not only parents，but also abnormal seeds caused by out-crossing and mechanical mixing.

Key words：Two-line super rice；Fengliangyou 4；SSR；Fingerprinting map；Purity

品种质量包括真实性和纯度，是目前我国杂交水稻推广环节中最突出的问题之一，每年都有不少假种和低纯度的种子出售，给农民和农业生产造成了很大损失。品种的真实性检验和纯度鉴定是防止假冒伪劣种子进入市场的重要手段[1，2]。因此，建立简便、经济、快速、准确的种子真实性和纯度鉴定技术对种子生产经营部门和广大农民来说具有重要意义。

SSR标记具有共显性、多态性高、重复好和简单快捷等特点，同时符合作物品种鉴定的4个基本准则即环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和试验结果的可靠性，且鉴定时间短、费用适中，因而SSR标记法成为当前应用最广的种子室内真实性及纯度检验方法[3-5]。此外，新修订的GB/T3543.5-1995《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》将“田间小区种植是鉴定品种真实性和测定品种纯度的最为可靠、准确的方法”修改为“田间小区种植是鉴定品种真实性和测定品种纯度的可靠方法之一”（即认可其它准确、可靠的品种真实性和纯度鉴定方法），并特别指出，针对品种真实性验证或身份鉴定，允许采用SSR和SNP分子标记方法；同时，新种子法第四十七条规定：“农业、林业主管部门可以采用国家规定的快速检测方法对生产经营的种子品种进行检测，检测结果可以作为行政处罚依据”，其中，快速检测方法即包括DNA检测方法。

“丰两优四号”属籼型两系杂交水稻，是合肥丰乐种业股份有限公司自主选育的两系杂交水稻新品种，该品种产量高、米质优，且具有较好的抗病性，2007年入选农业部超级稻并列为第二批超级稻示范推广品种，2009年通过国家审定，2011年被列为长江中下游中籼稻迟熟组筛选试验对照品种。本研究拟利用农业部颁布的行业标准《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T 1433-2014）中推荐的48个SSR标记，构建丰两优四号的指纹图谱，并筛选适合的特征引物用于该杂交种纯度的快速鉴定，为加强种子质量控制，打击假冒伪劣种子，保护育种者、种子生产经营企业和农民的合法权益提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料 供试材料为纯度合格的丰两优四号标准样品及其亲本，以及制种过程中混杂严重，但是纯度未知的丰两优四号检测样品，均由合肥豐乐种业股份有限公司提供。SSR引物和DNA聚合酶购自上海生工生物工程技术服务中心，引物序列来自中华人民共和国农业行业标准《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T 1433-2014）。

1.2 方法

1.2.1 发芽 按照《农作物种子检验规程》（GB/T3543.4—1995）要求，每个样品随机取220粒种子，均匀置于发芽床上，温度为30℃、光照为750lx、湿度为75%的条件下发芽3～7d。

1.2.2 DNA提取及测定 指纹图谱构建材料（丰两优四号标准样品及其亲本）取长4cm左右的幼苗，采用改良CTAB法[6]提取幼苗总DNA，其中，丰两优四号标准样品提取4株幼苗DNA，亲本各提取2株幼苗DNA。纯度鉴定材料（丰两优四号检测样品）采用碱煮法快速提取幼苗总DNA：剪取0.5cm长的水稻幼苗，放入96孔PCR板的孔中，每孔加入40μL 0.2mol/L的NaOH，在沸水中煮30s，然后加入60μL 0.17mol/L的Tris-HCl，在沸水中煮沸2min，每份材料提取188株幼苗DNA，4℃保存备用。以上提取的DNA，利用Nanodrop 2000C型核酸蛋白分析仪测定其浓度和质量。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体积为10μL，其中含模板2.0μL（浓度为20～50ng/μL），10×PCR Buffer 1.0μL，dNTP（2.5mM）0.9μL，正反向引物（50ng/μL）各0.5μL，DNA聚合酶（5U/）0.1μL，双蒸水5μL。PCR反应条件为94℃变性4min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环，再72℃延伸7min，12℃保存。

1.2.4 电泳检测 PCR扩增产物采用4%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。指纹图谱构建时点样一次，即使用100孔密型点样梳一次性点样96孔PCR板上的96个样品，在2000V，85W条件下电泳25min后，染色、显影，观察带型、统计结果数据；纯度检测时点样两次，即使用100孔密型点样梳一次性点样96孔PCR板上的96个样品（包括2个亲本对照），在2000V，85W条件下，先电泳10min后，点样另外98个样品包括2个亲本对照），继续电泳25min后，染色、显影，观察带型、统计结果数据。

2 结果与分析

2.1 丰两优四号DNA指纹图谱的构建 对丰两优四号标准样及其亲本使用48对标准SSR引物进行PCR扩增，均能检测到清晰的DNA谱带，对PCR擴增片段赋予数值，构建了丰两优四号标准样及其亲本的数字指纹图谱（表1）。其中，19对引物在父母本间具有多态性，丰两优四号杂交种呈现双亲互补带型（图1），可用于该品种的纯度鉴定。

2.2 丰两优四号纯度快速鉴定 采用碱煮法快速提取混杂严重但是纯度未知的丰两优四号检测样品190株幼苗的DNA，以亲本（父、母本）作为对照，选取多态性好、谱带清晰稳定、非特异性扩增少的2对引物（RM224、RM336）进行PCR扩增，在4%变性聚丙烯酰胺凝胶上两次点样和电泳并分析结果，谱带中出现双亲互补带型的为杂交种，其他带型为杂株（图2），以此计算纯度的百分率=杂交种单株数/检测单株数（不包括未检测到电泳谱带而数据缺失的单株），并分别对RM224和RM336的扩增片段赋予数值，将电泳图谱转换为DNA数字指纹（表2），分析丰两优四号检测样品中不同混杂的类型及原因。

结果表明，用RM224标记检测丰两优四号检测样品的纯度为157/189=83.1%（单株2-58数据缺失），检测到32个杂株，包括3种杂株类型（图2A），其中，两种杂株类型是含有母本带型和不同于父本带型的串粉杂合带型（数字指纹分别为2/4和2/3），一种杂株类型是仅具有母本带型的自交种带型（数字指纹为2/2）；用RM336标记检测丰两优四号检测样品的纯度为129/189=68.3%（单株2-58数据缺失），检测到60个杂株，包括5种杂株类型（图2B），其中，3种杂株类型是含有母本带型和不同于父本带型的串粉杂合带型（数字指纹分别为4/6、3/6和1/6），一种杂株类型是仅具有母本带型的自交种带型（数字指纹为6/6），一种杂株类型是不含有母本带型的机械混杂带型（数字指纹为1/5）；结合RM224和RM336两个标记共检测到63个杂株，包括了15种杂株类型（表2），其中，RM336标记检测到的60个杂株中包含RM224标记检测到的32个杂株中的29株，但未检测到RM224标记检测出的另外3个杂株（1-84、1-86和1-91），此外，RM336检测到的3个母本带型的单株（1-67、1-90和1-78），在RM224位点为正常杂交种带型或混杂带型，而RM224检测到的10个母本带型的单株（1-36、2-3、2-10、2-33、2-69、2-77、2-81、2-63、1-84和1-86），在RM336位点为正常杂交种带型或混杂带型，说明这13个杂株为串粉或机械混杂种而非自交种，而在RM224和RM336标记位点均为母本带型的4个杂株（1-87、2-1、2-14和2-70）是否为自交种，需要检测更多标记位点进行验证。由此可见，标记RM336较RM224对丰两优四号检测样中杂株的鉴别力更强，但2个标记结合对杂株类型鉴别更准确。

3 结论与讨论

DNA指纹能从本质上反应生物个体差异，具有较高的多态性，绘制的品种指纹图谱具有个体特异性，能在避免外界环境干扰的情况下快速、准确、稳定的鉴定品种，成本低并且能鉴定表型难以鉴定的品种[7，8]。本研究利用农业部颁布的行业标准《水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法》（NY/T 1433-2014）中推荐的48个SSR标记，构建了丰两优四号标准样的DNA指纹图谱，为其品种权保护和真实性鉴定、打击假冒伪劣种子提供了重要依据。

有效利用DNA分子标记技术建立当前杂交稻主要栽培种的DNA指纹图库及品种特有的DNA指纹数据库，也是解决杂交稻纯度鉴定的有效途径之一[9]。研究结果表明SSR标记法与田间正季纯度鉴定结果基本一致，最大相差11.2%，其平均差距为0.9%，而海南异地小区种植纯度鉴定结果与田间正季纯度鉴定结果差异较大，最大相差44.0%，其平均差距为3.6%[10，11]。本研究依据指纹图谱，筛选到适合丰两优四号杂交种纯度鉴定的引物15个，均能区分父本或母本混杂；通过纯度快速鉴定实践，发现RM224和RM336为丰两优四号的特征引物，能区分父母本混杂的同时，还能鉴别串粉和机械混杂等因素造成的多种异品种，从而为该品种纯度的快速、准确鉴定提供了技术保障。

参考文献

[1]兰琴英，陈泽辉，祝云芳，等.优良玉米杂交种金玉818指纹图谱构建及其纯度鉴定[J].贵州农业科学，2015，43（6）：1-6.

[2]杜雪树，戚华雄，夏明元.杂交中稻广两优476品种与纯度的鉴定[J].湖北农业科学，2012，51（6）：1254-1262.

[3]郭承亮.SSR 分子标记在杂交稻种子纯度精确鉴定中的应用[J].中国种业，2014（1）：21-23.

[4]郭向阳，陈泽辉，祝云芳，等.利用 SSR标记鉴定玉米杂交种黔单16号纯度的研究[J].种子，2011，30（4）：42-44.

[5]徐艳芳，向珣朝，张艳丽，等.SSR技术对杂交稻种冈优188的纯度鉴定[J].种子，2012，31（7）：126-128.

[6]Murray MG，Thompson WF. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nuc Acids，1980，8：4321-4325 .

[7]朱珊，黄仁良，孙娜，等.江西省2009 年水稻区试品种的 DNA 指纹图谱构建及遗传多样性分析[J].江西农业学报，2010，22（9）：20-23.

[8]朱卫红，齐建双，铁双贵，等.DNA 指纹图谱在玉米杂交种真伪及纯度鉴定中的应用[J].河南农业科学，2007（10）：33-36.

[9]李燕平，谭艳平，徐鑫，等.水稻特异分子标记的建立及其在新品种骏优522的应用[J].农业生物技术学报，2013，21（11）：1295-1301.

[10]郭奕生，陆俊.微卫星标记在杂交稻种子纯度鉴定上的应用[J].广东农业科学，2014（16）：138-141.

[11]周会，苏秀，毛双林，等.利用SSR分子标记鉴定两系杂交水稻品种纯度试验[J].种子世界，2014（4）：30-32.

（责编：张宏民）