韩兴+刘亚南+甄丹妹++刘大群+赤国彤

摘要：以玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63为发酵菌株，采用Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、中心复合试验设计和响应面分析法，以抗生素产量为响应值，对其发酵培养基进行优化。首先，采用Plackett-Burman设计筛选出具有正显著效应的花生饼粉和玉米浆。其次，通过最陡爬坡试验逼近最大响应区域。最后，采用中心复合试验对这2个因素进行优化。最终确定发酵的最适培养基含量配方为葡萄糖2%，可溶性淀粉1%，花生饼粉4.96%，玉米浆2.66%，氯化钠0.4%，碳酸钙0.3%，磷酸二氢钾0.02%。优化后发酵培养基抗生素产量为2 030.6 mg/L，比优化前的771.9 mg/L 提高了1.63倍。

关键词：玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63；发酵；抗生素；响应面分析

中图分类号： S476+.8文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0100-03

玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus） Men-myco-93-63是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离到的1株对多种植物病原菌具有抑制作用的拮抗链霉菌[1]。通过研究发现，该菌及其次生代谢产物对不同致病力的棉花黄萎病菌都有很强的抑制作用，可以导致黄萎病菌菌丝变形，并伴随有溶菌作用[2-3]。温室及大田试验结果表明，其发酵液对棉花黄萎病有较好的田间防效[3]。赵志泉等从玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63发酵液中分离得到抑制棉花黄萎病菌的抗生素，并对其性质和结构进行了分析，但并未明确其具体结构[4]。张艳对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的发酵培养基和发酵条件进行了研究，筛选出了较适宜的发酵培养基[5]。[JP]

Plackett-Burman法基于不完全平衡块原理，能从众多变量中快速筛选出最为重要的因素[6]。响应面方法（response surface methodology，RSM） 能将试验设计和数学建模联合起来，通过局部试验回归拟合因素与结果间的全局函数关系[7]，得到准确有效的试验结论。本试验在前期试验研究基础上，以抗生素产量为目标响应值，通过一系列统计学方法，改良发酵培养基的组分含量，以期提高发酵过程中抗生素的产量。[JP]

1材料与方法

[HTK]1.1试验材料[HT]

1.1.1供試菌株

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63菌株，由河北农业大学植物保护学院分子植物病理学和植物病害生物防治实验室保存。

1.1.2培养基

PDA培养基；初始发酵培养基含量配方：葡萄糖2.4%，可溶性淀粉0.8%，花生饼粉1.5%，玉米浆08%，氯化钠0.4%，碳酸钙0.3%，磷酸二氢钾0.02%。

1.2试验方法

1.2.1发酵培养

将玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在PDA培养基上培养 14 d 至孢子发育成熟，将孢子刮下，制成孢子悬浮液，调整孢子浓度为5×108 CFU/mL，向装有100 mL发酵培养基的 500 mL 三角瓶中接入200 μL孢子悬浮液，在30 ℃、200 r/min 的摇床上振荡培养5 d。

1.2.2抗生素标准曲线绘制

准确称取0.010 3 g抗生素标准品，抗生素提取方法参照赵志泉等的方法[4]。加80%乙醇溶解，容量瓶中定容至 50 mL，得浓度为0.206 mg/mL的抗生素溶液，梯度稀释8、10、12、14、16、32、64倍至浓度分别为0025 8、0.020 6 、0.017 2、0.014 7 、0.012 9、0.006 4、0.003 2 mg/mL，测定不同浓度溶液在363 nm处的吸光度，绘制标准曲线。

1.2.3抗生素含量测定方法

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63所产生的抗生素不溶于水，即存在于发酵液的沉淀中。将发酵液摇匀，取5 mL发酵液，加入20 mL乙醇，振荡混匀，此时抗生素即溶于液相（含有80%乙醇）中，12 000 r/min离心 3 min，将上清液稀释40倍，紫外分光光度计测其在 363 nm 处的吸光度，即为响应值。代入标准曲线中计算浓度。[JP]

1.2.4Plackett-Burman（PB）试验

利用Design Expert 8.0.6.1 软件，选取n=12的Plackett-Burman试验设计，对初始发酵培养基中7个组分进行考察，试验因素和水平见表1，试验设计见表2。每个试验点重复3次，取平均值。

1.2.5最陡爬坡试验

1.2.7最优发酵培养基验证

根据中心复合试验和响应面分析得到的最优发酵培养基，以初始培养基为对照，进行发酵验证试验，重复5次，求其平均值。

2结果与分析

2.1抗生素标准曲线的绘制[HT]

以抗生素浓度为横坐标（x），363 nm处的吸光度为纵坐标（y）作图（图1），得到线性回归方程y=50.844x+0.050 6，r=0.999 5，在所测浓度范围内线性关系良好。

2.2Plackett-Burman试验设计与结果

PB试验结果和方差分析分别如表2、表6所示，模型确

2.3最陡爬坡试验设计与结果

由表6可知，花生饼粉含量和玉米浆含量都为正效应，效应系数分别为0.061和0.071，根据这2个因素的效应大小确定爬坡步长，其他不显著因素均取低水平，试验设计与结果如表3所示。由表3可知，D363 nm最大值出现在第2组试验附近，因此将其作为后续中心复合试验的中心点。

2.4中心复合试验设计与结果

试验共设13个试验点，其中包括8个析因点和5个中心点，对试验结果进行二次二元回归拟合，得到回归方程Y=0550-0.079C-0.038D-0.025CD-0.068C2-0.037D2，模型R=0.985 4，表明模型拟合良好，对回归方程进行方差分析，P<0.000 1，模型极显著，失拟项P=0.078 7不显著，说明模型有意义，因此可用此模型分析預测响应值。同时，由表7可知，交互项CD的P=0.010 5，达到显著水平，说明花生饼粉含量和玉米浆含量存在一定的交互作用，响应曲面及等高线图如图2所示，响应曲面存在极值点。

以363 nm处紫外吸光度最大即抗生素产量最大为目标，利用Design expert 8.0.6.1软件对回归方程求解极大值，得到最终优化结果为花生饼粉含量4.96%，玉米浆含量266%。在最佳优化条件下预测的最佳响应值为0.574 7。

2.5最优条件验证

为了验证预测值，按照优化后的条件进行验证试验，结果如表8所示。优化后D363 nm为0.566 8与预测值0.574 7非常接近，可见该模型能很好地预测发酵过程中抗生素的产量。将D363 nm代入标准曲线中，并按照稀释浓度计算，可得优化后抗生素产量为2 030.6 mg/L，比优化前的771.9 mg/L提高了

3结论与讨论

玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus）Men-myco-93-63对棉花黄萎病有较强的抑制作用，但利用发酵液进行生物防治在成本、运输、保存等方面存在诸多不便，因此，从发酵液中提取分离得到抗生素尤为必要，而发酵培养基对抗生素的代谢合成有着重要影响[9]。因此本试验通过改良发酵培养基来获得更高的抗生素产量。

响应面法作为一种统计学方法，近年来已被广泛应用于生物领域[10-13]，特别是发酵行业，相对于正交试验只能对单个孤立的试验点进行分析，响应面法在试验条件寻优过程中可以连续地对试验的各个水平进行分析，因而可以得到更为准确的最优条件。

本试验利用Plackett-Burman试验设计从初始发酵培养基中筛选出花生饼粉含量和玉米浆含量2个影响抗生素产量的主要因素。在此基础上，通过最陡爬坡试验找到其最优值区域，在花生饼粉含量为6%、玉米浆含量为3%附近。并以此为中心复合试验设计的中心点，用响应曲面分析法确定花生饼粉含量和玉米浆含量的最佳因素水平分别为4.96%、266%。最后按照响应面优化的培养基进行验证试验，得到实际抗生素产量为2 030.6 mg/L，与模型预测值非常接近，并且，相对于初始发酵培养基的 771.9 mg/L，抗生素产量提高了1.63倍。

参考文献：

[1]Liu D Q. Biological control of Streptomyces scabies and other plant pathogens[D]. Minnesota：University of Minnesota，1992.

[2]Meng Q F，Yang W X，Zhang Q L，et al. Field evaluation of antagonistic Streptomyces Men-myco-93-63 preparation in biocontrol of cotton verticillium wilt[C]//Proceedings of the 15th International Plant Protection Congress. Beijing：Foreign Languages Press，2004：153.

[3]刘大群，杨文香，祁碧菽，等. 拮抗链霉菌Men-myco-93-63及其发酵液对棉花黄萎病菌生长的影响[J]. 河北农业大学学报，1999，22（4）：79-82.

[4]赵志泉，赤国彤，孟庆芳，等. 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63有效成分的初步提取与纯化[J]. 河北农业大学学报，2007，30（1）：76-78.

[5]张艳.生防菌株Men-myco-93-63发酵工艺优化研究[D].保定：河北农业大学，2006.

[6]Sayyad S A，Panda B P，Javeed S，et al. Optimization of nutrient parameters for lovastatin production by Monascus purpureus MTCC 369[LM]

[KG1*2/3]under submerged fermentation using response surface methodology[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73（5）：1054-1058.

[7][JP3]梅乐和，胡升，许静，等. 纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶发酵条件优化[J]. 浙江大学学报（工学版），2004，38（10）：1355-1360.[JP]

[8]刘青芝，李霞，苏移山，等. 响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵条件[J]. 中国生化药物杂志，2011，32（2）：99-102.

[9]卢彩鸽，董红平，张殿朋，等. 解淀粉芽胞杆菌MH71摇瓶发酵培养基及发酵条件优化[J]. 中国生物防治学报，2015，31（3）：369-377.

[10]Jung J P，Moyano J V，Collier J H. Multifactorial optimization of endothelial cell growth using modular synthetic extracellular matrices[J]. Integrative Biology，2011，3（3）：185-196.

[11]Li X Y，Liu Z Q，Chi Z M. Production of phytase by a marine yeast Kodamaea ohmeri BG3 in an oats medium：optimization by response surface methodology[J]. Bioresource Technology，2008，99（14）：6386-6390.

[12]Yuan L L，Li Y Q，Wang Y，et al. Optimization of critical medium components using response surface methodology for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-18Q[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering，2008，105（3）：232-237.

[13]Li C，Bai J H，Cai Z L，et al. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis，using response surface methodology[J]. Journal of Biotechnology，2002，93（1）：27-34.

[FQ）]

江苏农业科学2017年第45卷第10期

[SQ*5]

[HT6F]李素霞，莫小荣，覃雪梅，等. 氮镉交互作用下石灰对白菜的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（10）：103-105.