袁晓琴, 刘梦茜, 李春燕, 陈仕怡, 许丽惠, 周五朵, 吴异健, 王全溪

(福建农林大学福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福建 福州 350002)



鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

袁晓琴, 刘梦茜, 李春燕, 陈仕怡, 许丽惠, 周五朵, 吴异健, 王全溪

(福建农林大学福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福建 福州 350002)

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析，选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15～1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增，并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒，将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件，纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明，pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明，重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25 ℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明，100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白，获得较多的纯化蛋白.免疫结束后，抗体效价检测结果表明，制备的多克隆抗体效价达1∶32 000，可以与重组蛋白特异结合.

鸡蛋白激酶R样内质网激酶(PERK); 原核表达; 多克隆抗体

内质网是由细胞质内膜组成的一些片状的囊腔和管状的腔，这些管腔相互连接形成了密闭的管道.机体内蛋白质和脂肪的合成主要是在内质网中进行的，除此之外，内质网还可以进行蛋白质的修饰、折叠以及钙离子的贮存等.正常情况下，蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)主要通过其管腔内结构域与内质网伴侣蛋白Bip蛋白相结合，结构相对稳定[1].PERK 是内质网I型跨膜蛋白中的一……