胡家勇，柳迪，程银棋，彭青枝*

（湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉430060）

荧光分光光度法测定淀粉及其衍生物中二氧化硫残留量研究

胡家勇，柳迪，程银棋，彭青枝*

（湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉430060）

建立荧光分光光度法测定淀粉及其衍生物中二氧化硫残留量的方法。在弱酸性条件下，以邻苯二甲醛/铵盐为荧光指示剂，亚硫酸氢钠为定量标准，荧光强度作为考察指标，测定样品中的二氧化硫残留量。结果表明，标准曲线的线性回归方程为Y=23.22X+0.854，线性相关系数R2=0.999 8、检出限为0.732 mg/kg、加标回收率在95.3%～104.8%之间、精密度良好、检测结果可靠。荧光分光光度法可以作为淀粉及其衍生物中二氧化硫残留量的测定方法。

荧光分光光度法；比色法；二氧化硫残留量；淀粉及其衍生物

亚硫酸盐作为一种漂白剂、抗氧化剂和抗菌剂，广泛地应用在食品工业中。亚硫酸盐常被用作食品清洁和保存，检测结果通常以二氧化硫残留量计。淀粉是一种多糖，是植物贮存能量的一种方式，淀粉除食用外，也是食品行业的重要配料，工业上用于制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等。淀粉也是百姓日常生活中必不可少的原料之一。为了保证产品的白度，淀粉提取工艺中会使用二氧化硫达到漂白的目的，如马铃薯淀粉提取时，由于马铃薯块茎中含有络氨酸酶会使淀粉变色，因此粉碎时通入二氧化硫，以抑制络氨酸酶的作用[1]。二氧化硫对人体有很大伤害，长期或大剂量摄入可造成胃肠和肝脏的损坏，会使血红蛋白减少[2-5]，因此国家规定淀粉中二氧化硫残留量不得超过30.00 mg/kg[6]。食品中二氧化硫残留量测定的常规方法是采用国标GB 5009.34—2016《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》中的滴定法[7]及盐酸副玫瑰苯胺比色法[8]，滴定法存在终点不敏锐，方法重复性与准确性差，并且需要蒸馏，过程比较繁琐，不适合大量样品的检测；而盐酸副玫瑰苯胺比色法所使用的吸收液四氯汞钠存在重金属汞污染，方法不环保；其他测定食品中二氧化硫的方法尚有高效液相色谱法[9-10]、气相色谱法[11-13]、离子色谱法等[14-16]，几种色谱法需要相应的设备及填充柱，检测成本较高，对检测人员的素质要求也较高。

本研究是基于在弱酸性条件下亚硫酸氢盐、亚硫酸盐与邻苯二甲醛、乙酸铵反应能够生成异吲哚-1-磺酸盐荧光化合物，建立了荧光光度法测定淀粉及其衍生物中二氧化硫残留量，以期为淀粉及其衍生物中二氧化硫残留量的测定提供一个方法参考，也可作为食品中二氧化硫残留量测定的参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淀粉样品均是市场抽检样品。

亚硫酸氢钠、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（均分析纯）：Aladdin科技（中国）有限公司；乙酸铵、无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

F-4600分子荧光分光光度计：日本日立公司；ME203/02电子天平、ME2002E/02电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；827 pH Lab pH计：瑞士万通有限公司；MEMMERT WNB29水浴锅：德国Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 荧光衍生法原理

在弱酸性条件下亚硫酸氢盐、亚硫酸盐与邻苯二甲醛、乙酸铵反应生成异吲哚-1-磺酸盐荧光化合物[17]，荧光强度与其浓度呈正比。以亚硫酸氢钠作为对照品，用来定量样品中的二氧化硫残留量。

1.3.2 检测波长的确定

吸取亚硫酸氢钠使用液0.3 mL（相当于15 μg二氧化硫），置于25 mL带塞比色管中，依次加入磷酸盐缓冲溶液2.0 mL、邻苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸铵1.5 mL，混匀，用水定容至刻度，于50℃水浴中反应5 min，取出，放入冰水中冷却，静置30 min后用荧光分光光度计扫描吸收和发射光谱图，确定最佳激发波长和发射波长。

1.3.3 试剂配制

亚硫酸氢钠对照品储备液：精密称取亚硫酸氢钠对照品0.250 0 g，加水溶解定容至100 mL，避光冷藏，备用，使用前按下述方法标定。

吸取10.0 mL亚硫酸氢钠水溶液于250 mL碘量瓶中，加100 mL水，准确加入20.00 mL碘溶液（0.1 mol/L），5 mL冰乙酸，摇匀，放置于暗处，2 min后迅速以硫代硫酸钠（0.100 mol/L）标准溶液滴定至淡黄色，加0.5 mL淀粉指示液，继续滴定至无色。另取110 mL水，准确加入碘溶液20.0 mL（0.1 mol/L）、5 mL冰乙酸，按同一方法做试剂空白试验。二氧化硫标准溶液的质量浓度计算公式如下：

式中：X—二氧化硫标准溶液质量浓度，mg/mL；V1—亚硫酸氢钠储备液消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mL；V2—试剂空白消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mL；c—硫代硫酸钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L；32.03—每毫升硫代硫酸钠标准溶液相当于二氧化硫的质量，mg。

亚硫酸氢钠使用液：临用前将亚硫酸氢钠储备液稀释成每毫升相当于50 μg二氧化硫。

邻苯二甲醛溶液：准确称取邻苯二甲醛26.82 mg，用无水乙醇溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，即得。避光冷藏，临用新配。

乙酸铵溶液：称取乙酸铵0.3850g，用去离子水溶解，定容至1 000 mL容量瓶中，即得。

磷酸盐缓冲溶液：准确称取磷酸氢二钠2.13 g、磷酸二氢钾2.04 g，加水溶解后定容至100 mL容量瓶中，即得。

1.3.4 亚硫酸氢钠标准曲线绘制

吸取亚硫酸氢钠使用液0、0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL（相当于0、0.5 μg、1.5 μg、2.5 μg、5.0 μg、15.0 μg、25.0 μg二氧化硫），分别置于25 mL带塞比色管中，依次加入磷酸盐缓冲溶液2.0 mL、邻苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸铵1.5 mL，混匀，用去离子水定容至刻度，于50℃水浴中反应5min，取出，放入冰水中冷却，静置30min，于1cm的石英比色皿中测定荧光强度。以二氧化硫含量（x）为横坐标、荧光强度（y）为纵坐标绘制亚硫酸氢钠标准曲线。

1.3.5 荧光化合物生成及测定[17]

准确称取样品2.50 g于50 mL离心管中，40℃水浴振荡提取后，移取样品溶液10.0 mL于25 mL带塞比色管中，依次加入磷酸盐缓冲溶液2.0 mL、邻苯二甲醛溶液2.5 mL、乙酸铵1.5 mL，混匀，用水定容至刻度，于50℃水浴中反应5 min，取出，放入冰水中冷却，静置30 min，于1 cm的石英比色皿中测定荧光强度。按照亚硫酸氢钠标准曲线回归方程计算样品中二氧化硫残留量，其计算公式如下：

式中：X—二氧化硫残留量，mg/kg；m—测定用试样中二氧化硫残留量的质量，μg；V1—样品定容体积，mL；V2—样液移取体积，mL；M—样品称取质量，g。

2 结果与分析

2.1 检测波长

设定发射波长为390nm，扫描激发波长，激发光谱分别在波长221 nm和320 nm处出现二个光谱峰，结果见图1。设定激发波长为221 nm，扫描发射波长，最大发射光谱峰在386 nm；设定激发波长为320 nm，扫描发射波长，最大发射光谱峰在386 nm，结果见图2。

图1 荧光激发光谱图Fig.1 Fluorescence of excitation spectra

图2 荧光发射光谱图Fig.2 Fluorescence of emission spectra

根据波长扫描确定激发、发射波长后，试验过程中荧光分光光度计参数设置如下：激发波长、发射波长221nm、386nm和320nm、386nm，积分时间0.1s，延迟时间0.1 s，激发波长狭缝宽度5.0 nm，发射波长狭缝宽度5.0 nm，光电倍增管电压250 V。

2.2 亚硫酸氢钠标准曲线绘制

分别在激发、发射波长分别为221nm、386nm和320nm、386 nm条件下绘制亚硫酸氢钠标准曲线，结果见图3。由图3可知，在0～1 000 μg/L范围内，激发波长320 nm、发射波长386 nm条件下，亚硫酸氢钠标准曲线回归方程的线性相关性（0.999 8）优于激发波长221 nm、发射波长386 nm条件下的线性相关性（0.984 0），虽然二者在0～600 μg/L范围内有一致的线性相关性，但是线性范围变窄。因此，确定最佳激发、发射波长分别为320 nm和386 nm。

图3 亚硫酸氢钠标准曲线Fig.3 Standard curve of sodium bisulfite

2.3 方法学验证

2.3.1 方法精密度试验

表1 精密度试验结果Table 1 Results of precision experiments

称取3个未知二氧化硫残留量的淀粉各5份进行平行性试验，结果见表1。由表1可知，3个二氧化硫残留量不同的样品平行性试验结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均＜10%，结果表明该方法精密度良好。

2.3.2 方法最低检测限

表2 检出限测定结果Table 2 Detection results of limit of detection

由表2可知，连续11次进空白样品，根据3倍标准偏差计算得出本方法二氧化硫检出限为0.732 mg/kg。

2.3.3 方法加标回收率试验

称取已知二氧化硫含量的淀粉3份，精确加入亚硫酸氢钠对照品溶液适量（相当于加入二氧化硫含量是70 μg），按供试品溶液的制备与测定同法操作，计算二氧化硫加标回收率，结果见表3。由表3可知，方法的回收率在95.3%～104.8%之间，说明该检测方法具有良好的准确性。

表3 加标回收率试验结果Table 3 Results of adding standard recovery rate experiments

2.3.4 方法稳定性试验

表4 稳定性试验结果Table 4 Results of stability experiments

同一样品分别放置0、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h后测定一次，分别记录荧光强度，结果见表4。由表4可知，高质量浓度二氧化硫（30.231 mg/kg）荧光强度与低质量浓度二氧化硫（2.405mg/kg）荧光强度在2.0 h内均衰减不显著（P＞0.05），由此可以说明样品溶液在避光冷藏放置2.0h内稳定性良好。

2.3.5 荧光分光光度法与盐酸副玫瑰苯胺比色法、滴定法比较

淀粉中二氧化硫测定通常采用GB5009.34—2016《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》中的滴定法以及盐酸副玫瑰苯胺比色法，而关于荧光分光光度法测定淀粉中二氧化硫的报道则比较少。故将荧光分光光度法检测结果与国标滴定法、盐酸副玫瑰苯胺比色法的检测结果进行比较，结果见表5。由表5可知，3种方法的测定结果无显著差异（P＞0.05），且荧光分光光度法精密度更好。由此可见，荧光分光光度法更适合测定淀粉及其衍生物中二氧化硫残留量。

表5 荧光分光光度法与比色法和滴定法比较Table 5 Comparison of fluorescence spectrophotometry with colorimetric method and titrimetry

3 结论

基于亚硫酸氢盐、邻苯二甲醛与铵盐反应生成荧光化合物的原理，本研究建立了荧光分光光度法作为测定淀粉及其衍生物中二氧化硫残留量的方法，该方法具有灵敏度高、操作简单等优点。标准曲线及方法学验证结果显示：方法的最低检测限为0.732 mg/kg，亚硫酸氢钠标准曲线线性回归方程y=23.22x+0.854，相关系数R2=0.999 8；精密度试验结果RSD为1.81%～5.16%，加标回收率在95.3%～104.8%之间，溶液在避光冷藏放置2 h内稳定，荧光分光光度法检测结果与GB 5009.34—2016《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》滴定法及盐酸副玫瑰苯胺比色法的检测结果无显著差异（P＞0.05）。结果表明荧光分光光度法可以作为测定淀粉中二氧化硫残留量的方法。

[1]余淑.淀粉中二氧化硫残留量测定的几种方法比较[J].淀粉工程，2012（1）：81-84.

[2]李利军，卢美欢，岳淑宁.蒜制品中二氧化硫的检出、来源及食用安全性分析[J].中国酿造，2010，29（1）：121-122.

[3]王淑艳.蘑菇罐头中二氧化硫残留量检测标准和方法的探讨[J].中国公共卫生管理，2006，22（1）：40-41.

[4]吴卫平，张磊，李洁，等.食品中二氧化硫残留快速检测方法的研究[J].上海预防医学杂志，2006，18（9）：470-471.

[5]李东奇，陈华成，杨雪丽.二氧化硫对机体各组织器官毒性作用的研究进展[J].兽牧兽医杂志，2008，27（1）：37-39.

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 2760—2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京：中国标准出版社，2014.

[7]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.34—2016食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

[8]李建伟，朱亚民，刘博，等.盐酸副玫瑰苯胺比色法测定亚硫酸盐[J].分析实验室，2001，20（10）：35-37.

[9]STEPHEN W C,BENNY T P C,ANDY C M C.Determination of free and reversibly-bound sulfite in selected foods by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection[J].J AOAC Int,2008,91 (1):98-102.

[10]WANG X H,XIE P S,LAM CHRIS W K,et al.Study of the destructive effect to inherent quality ofAngelicae dahurcaeradix(Baizhi)by sulfurfumigated process using chromatographic fingerprinting analysis[J].J Pharm Biomed Anal,2009,49(5):1221-1225.

[11]王晓云，龚汉卿，王明林.顶空气相色谱法测定膨化大枣中的亚硫酸盐含量[J].山东化工，2007，36（1）：36-38.

[12]孙艳平，李涛.顶空气相色谱-火焰光度检测器检测山药中的二氧化硫[J].陕西医学杂志，2010，39（8）：1024-1025.

[13]郏征伟，毛北萍，苗水，等.顶空气相色谱法测定硫黄熏蒸中药材中二氧化硫的残留量[J].药学学报，2014，49（2）：277-281.

[14]罗建民，王爱霞，陈俊宇.离子色谱法测定葡萄干中二氧化硫残留量[J].食品研究与开发，2014，35（4）：90-92.

[15]王欣美，夏晶，王柯，等.碱性溶液提取-离子色谱法测定中药中二氧化硫残留量[J].中国中药杂志，2011，36（19）：2656-2659.

[16]HASSON M,UWE S.Sensitive and selective flow injection analysis of hydrogensulfite/sulfurdioxidebyfluorescencedetectionwithandwithout membrane separation by gas diffusion[J].Anal Chem,2001,73(13): 3187-3192.

[17]彭月，李雪莲，银玲，等.荧光衍生法测定中药二氧化硫残留量研究[J].中国中药杂志，2013，38（2）：212-215.

Determination of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives by fluorescence spectrophotometry

HU Jiayong,LIU Di,CHENG Yinqi,PENG Qingzhi*
(Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test,Wuhan 430060,China)

The determination method of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives by fluorescence spectrophotometry was established.In weak acid conditions,using the o-phthalaldehyde/ammonium salt as fluorescent indicator,sodium bisulfite as quantitative standard,fluorescence intensity as evaluation index,the sulfur dioxide residue content in simples was determined.The results showed that the linear regression equation of standard curve wasY=23.22X+0.854.The linearly dependent coefficient(R2)was 0.999 8,the limit of detection was 0.732 mg/kg,the adding standard recovery rate was in the range of 95.3%-104.8%,which indicated that the method had good precision and reliable test results.The fluorescence spectrophotometry could be used for determination method of sulfur dioxide residue in starch and its derivatives.

fluorescence spectrophotometry;colorimetric method;sulfur dioxide residue;starch and its derivatives

O657.31

0254-5071（2017）06-0175-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.036

2017-03-10

胡家勇（1990-），男，助理工程师，硕士，研究方向为食品质量与安全。

*通讯作者：彭青枝（1967-），女，研究员，博士研究生，研究方向食品质量与安全。