赵 林，王志学，齐芳华，牟林茂，李安源

(山东大学附属省立医院，济南 250021)



【实验研究】

宁肾颗粒对IgA肾病大鼠肾脏系膜细胞凋亡的影响❋

赵 林，王志学，齐芳华，牟林茂，李安源△

(山东大学附属省立医院，济南 250021)

目的：研究宁肾颗粒对IgA肾病(IgAN)大鼠系膜细胞(MsC)凋亡的影响。方法：32只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、宁肾颗粒低剂量和高剂量组并复制IgAN模型，造模后药物干预4周分别给予生理盐水，生理盐水，低、高剂量(12g/kg·d、24g/kg·d)宁肾颗粒。干预后，检测尿红细胞计数、24 h尿蛋白、系膜区病理、MsC的凋亡率、皮质Bax蛋白表达。结果：与空白对照组比较，模型组的尿红细胞计数和24 h尿蛋白定量均有增高，系膜区病理损害加重，MsC凋亡率、皮质区Bax蛋白表达均降低；较模型组，宁肾颗粒低剂量和高剂量组尿红细胞计数和蛋白定量均减少，宁肾颗粒高剂量组系膜区病理损害减轻、MsC凋亡率、Bax蛋白表达均升高。结论：宁肾颗粒可减轻IgAN模型大鼠的血尿、蛋白尿，其作用机制可能与上调Bax蛋白表达促进MsC凋亡，进而抑制MsC异常增殖有关。

宁肾颗粒；IgA肾病；系膜细胞；凋亡

IgA肾病(IgA nephropathy， IgAN)是临床常见原发性肾小球疾病[1]，其患病率在我国有快速增长趋势[2]。其主要特征性病理表现为以IgA为主的免疫球蛋白在肾小球系膜区及毛细血管袢的沉积。IgAN发病机制至今尚不明确，常病程迁延，每年约有1%～2%的患者进入终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)[3]，临床治疗有一定困难。宁肾颗粒是治疗IgAN的临床验方，前期研究明确其有效性及对系膜细胞异常增殖的影响[4-5]。该研究在前期研究基础上进一步研究宁肾颗粒对IgAN系膜细胞凋亡的影响，以明确其疗效机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)系美国MBCHEM公司产品，Bax(ab5714)多克隆抗体、GAPDH (ab9485)多克隆抗体购自abcam公司，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗系北京中杉金桥生物技术有限公司产品，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒及流式细胞仪FACSCan均系美国BD公司产，计算机凝胶成像分析系统(Alphaimager2200型)系美国Pharmacia Biotech公司生产，酶标仪(Spectra Max M2型)购自美国MOLECULAR DEVICES公司，蛋白垂直电泳槽、电转膜器械， 均系BIO-RAD公司生产，恒流/恒压电泳仪(EC250-90，Hybiad)购自IEC仪器公司，低温高速台式离心机(IEC Micranax RF型)购自德国Beckman公司，病理切片机(Leica RM2135型)购自德国LEICA公司。

1.2 IgAN大鼠模型复制

根据汤颖[6]和陆慧瑜[7]等报道的方法，复制IgAN大鼠模型。运用BSA+ LPS+四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)法建立实验性IgAN大鼠模型。32只大鼠分笼饲养于山东省立医院动物中心饲养室，人工照明明暗时间各半，饲养室湿度(55±5%)、温度(22±2)℃，适应1周。将SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组(Con组)、模型组(Mod组)、宁肾颗粒低剂量组(NSL组)和高剂量组(NSH组)4组。用蒸馏水溶解BSA，最终浓度100g/L，按照400 mg/kg(即4 mL/kg)剂量隔天灌胃8周；蓖麻油0.3 ml/次，CCl40.1 ml/次每周皮下注射1次共9周；第6周静脉注射LPS溶液0.05 mg(0.2 ml)1次，用生理盐水溶解LPS，制成最终浓度0.25 g/L的LPS溶液。Con组隔天灌胃等量蒸馏水(4 ml/kg)共8周，每周皮下注射生理盐水0.4 ml共9周；第6周给予生理盐水0.2 ml，尾静脉注射1次。

1.3 药物干预

宁肾颗粒由黄芪、仙茅、仙灵脾、白花蛇舌草、生地、萆薢、金樱子、覆盆子、益母草组成(6∶2∶2∶3∶2∶2∶2∶2∶3)，中药配方颗粒为华润三九产品(批号070415S～081251H)，造模9周后开始给药干预。NSL组给予宁肾颗粒12 g/kg·d灌胃(相当于临床成人等效剂量的1倍)，NSH组给予宁肾颗粒24 g/kg·d灌胃(相当于临床成人等效剂量的2倍)，Con组和Mod组大鼠给予等体积0.9% NaCL溶液灌胃，药物治疗共4周。

1.4 标本留取

第14周内收集24 h尿液备用，第14周末处死大鼠。腹腔注射戊巴比妥钠(3%、30 mg/kg)麻醉大鼠。固定大鼠，于剑突下剖开腹壁显露膈肌，沿胸正中线剖开胸壁暴露心脏；剖开腹壁暴露肾脏，用 9# 针头从心尖插入左心室，然后插入升主动脉并固定，剪开右心耳用生理盐水快速灌注(压力为 85 cm 水柱)。待右心耳灌注出的液体澄清，且肾脏由红褐色变为苍白色后停止灌注，剖取肾脏分离皮质以备进一步实验。

1.5 尿液红细胞、蛋白测定

留取24 h尿液，定量尿沉渣计数法检测IgAN大鼠尿红细胞数，考马斯亮兰法检测IgAN大鼠24 h尿蛋白定量。

1.6 肾小球系膜区病理观察

取少量肾组织在 4% 多聚甲醛中预处理24 h，然后取出标本常规包埋切片。将标本投入生物组织自动脱水机分别进行脱水、透明、浸蜡，然后入石蜡包埋机包埋。取制备好的肾组织切片做常规HE染色，光镜下观察肾小球系膜区病理改变，形态分0～Ⅲ级。0级:正常肾小球；Ⅰ级：系膜区宽度大于毛细血管直径呈节段性分布；Ⅱ级:系膜增生宽度大于毛细血管直径呈弥漫性分布;Ⅲ级:系膜增生宽度呈团块状聚集,弥漫指状分布。

1.7 细胞凋亡率测定

单细胞悬液的配置[9]:取小块儿肾组织剥取皮质部分，置于不锈钢网上(120目)、下置平皿，用剪刀剪碎，眼科镊轻搓组织，边搓边用0.9%氯化钠溶液冲洗，直至将组织搓完。采用铜质滤网(300目)滤过平皿中的组织研磨混悬液，去除细胞团块，采集细胞悬液低速离心2 min(800 r/min)；细胞凋亡或DNA含量的染色[9]：取0.1 ml单细胞悬液(1×105)，加入10%鸡血红细胞作内参标准与样本同步染色，加入碘化丙啶(PI) (PI: 50 mg/L， Triton-X100 1.0% )1 ml，置于2～8℃冰箱染色30 min，用铜质滤网(500目)滤过，制备合格的单细胞悬液，即可上机检测细胞凋亡率。

1.8 Western blot检测肾组织Bax蛋白表达

称取大鼠肾组织50 mg用剪刀剪碎，研磨器内研磨，常规组织总蛋白提取。根据BCA试剂盒操作说明测定样本内总蛋白质含量，计算样本内总蛋白浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接通电源，电压70 V，进行30 min预电泳，使胶中的杂质跑出。上样20 μg待测蛋白及5 μL的预染蛋白标准进行蛋白电泳。第一阶段电压30 V 60 min，第二阶段电压100 V大约90 min。常规蛋白质电转移后，封闭电转移后模1 h。用5%脱脂奶封闭液稀释Bax抗体(1∶500)或GAPDH抗体(1∶2 000)配制一抗反应液。将PVDF膜浸入一抗反应液中，置于摇床上摇荡，4℃过夜。用1×TBST 洗膜3次后，将PVDF膜浸入二抗反应液(1∶5 000)中，置于摇床上摇荡，室温下1 h。洗膜3次后，常规放射自显影留存定影胶片，应用生物凝胶电泳图像分析系统扫描定量，计算PDGF-BB条带与内参的光密度比值作为其相对含量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 尿红细胞计数、蛋白定量

表1显示，与空白对照组比较，模型组IgAN大鼠尿红细胞计数和24 h尿蛋白定量均有增加，差异有统计学意义(P<0.01)。而应用宁肾颗粒治疗后，尿红细胞计数、24 h尿蛋白定量较模型组均有降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

2.2 宁肾颗粒对IgAN大鼠系膜区组织病理的影响

表2显示，模型组大鼠肾脏组织病理系膜区增殖较空白组增加，差异有统计学意义(P<0.01)；宁肾颗粒高剂量组肾脏系膜区增殖较模型组减轻，差异有统计学意义(P<0.05)，而宁肾颗粒低剂量组与模型组比较差异无统计学意义。

2.3 宁肾颗粒对IgA大鼠系膜细胞凋亡的影响

表1图1显示，模型组大鼠系膜细胞凋亡率较空白对照组明显降低(P<0.01)；宁肾颗粒高剂量组系膜细胞凋亡率较对照组提高，差异有统计学意义(P<0.05)，而宁肾颗粒低剂量组未见明显差异。

2.4 宁肾颗粒对IgA大鼠皮质区Bax蛋白表达的影响

表1图2显示，模型组皮质区Bax蛋白较空白对照组表达降低，宁肾颗粒高剂量组较模型组皮质区Bax蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.01或P=0.01)。

表1 宁肾颗粒治疗后各组大鼠尿红细胞计数、蛋白定量、系膜细胞凋亡、Bax蛋白表达情况比较±s)

注：与空白对照组比较：*P< 0.01；与模型组比较：&P<0.05 ，#P< 0.01(下同)

图1 宁肾颗粒治疗对各组大鼠系膜细胞凋亡的影响

组别鼠数病理改变/例0ⅠⅡⅢ空白组88000模型组80026*宁肾颗粒低剂量组80233宁肾颗粒高剂量组80431&

图2 宁肾颗粒治疗后各组大鼠皮质区Bax蛋白表达注：从左至右依次为空白对照、模型组、宁肾颗粒低剂量组、宁肾颗粒高剂量组

3 讨论

IgAN临床特点以血尿为主，可伴有蛋白尿甚至出现肾病综合征，部分病例迁延不愈而发展为终末期肾病。目前治疗以免疫抑制剂如糖皮质激素及细胞毒药物为主，但有时糖皮质激素及细胞毒药物的副作用让患者较难接受，而中医药治疗IgAN确有一定的疗效。

“IgA肾病”在中医学中无此病名。结合其临床症状、体征、病程发展特点，IgA肾病属于中医“尿血、尿浊、水肿、腰痛、虚劳等范畴。课题组认为，脾肾虚弱、湿热内蕴为IgAN的重要病机，以健脾益肾、清热利湿之法拟定宁肾颗粒。方中黄芪、仙灵脾、仙茅可温补脾肾为君，辅以白花蛇舌草、萆薢、生地清热解毒、利湿化浊，佐以金樱子、覆盆子益肾固精，益母草以活血利水。组方用药寒温并用、攻补兼施，以奏补益脾肾、清利湿热之效。前期临床观察显示，宁肾颗粒联合糖皮质激素泼尼松治疗小儿难治性肾病综合征起到较好效果，且较为安全[5]。前期动物实验表明，宁肾颗粒对IgAN大鼠的肾脏有保护性作用，可以有效抑制系膜区增殖，抑制肾小球系膜区以IgA为主的免疫球蛋白沉积，且具有一定的量效关系[4]，但对于系膜细胞凋亡的影响尚不明确。

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式[9]。细胞凋亡的调控机制十分繁复，目前尚不十分明确，但近年研究人蛋白酶系统的联级反应和各种凋亡基因及其产物调节作用在细胞凋亡调控中十分重要。bcl基因家族是迄今研究最热门和深入的凋亡调控基因之一。bax基因属于bcl癌基因家族，这类基因本身不直接诱导凋亡，但能明显加速死亡信号诱导细胞凋亡[10-11]。另一方面，其高表达也能对bcl-2的凋亡抑制活性起到拮抗作用[11]。

研究表明，肾脏系膜细胞凋亡是防止MsC过度增殖的重要机制，是肾小球增生性疾病进展得以控制或消除的方式之一[12-13]。在各种肾小球疾病早期，细胞凋亡可以抑制过度增殖的细胞，对机体器官、组织保持正常机能是有益的。但在肾脏病晚期，凋亡程度又与肾功能恶化呈正相关[14]。多数研究显示，细胞凋亡不足与系膜增殖性肾炎的肾细胞数目增多相关。UDA等[15]研究发现，肾小球肾炎与Bcl-2基因表达异常相关。在IgAN患者肾活检标本中发现，Bcl-2基因表达上调且阳性发现主要集中在肾小球系膜损伤区，这提示系膜增殖性肾炎的发生发展与Bcl-2表达上调导致系膜细胞凋亡减少相关，系膜细胞增殖过度或凋亡不足可能是系膜增殖性肾炎系膜增生的重要因素[14]。本实验研究也发现，IgAN大鼠肾脏系膜细胞存在凋亡率下降。前期研究表明，宁肾颗粒能抑制IgAN系膜细胞的增殖[4]。本研究表明，宁肾颗粒能上调Bax蛋白表达促进诱导系膜细胞的凋亡，可能进而抑制系膜细胞的增殖。

综上，宁肾颗粒可减轻IgAN模型大鼠的血尿、蛋白尿，其作用机制可能与上调Bax蛋白表达促进MsC凋亡，进而抑制MsC异常增殖有关。

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Effects of Ning Shen Granule on the Apoptosis of Renal Mesangial Cells in Iga Nephropathy Rats

ZHAO Lin，WANG Zhi-xue，QI Fang-hua，MU Lin-mao， LI An-yuan△

(ShandongProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity，Jinan250021，China)

Objective: To research the effects of Ningshen Granule on apoptosis of mesangial cells (MsC) in rats with IgA nephropathy. Methods Thirty-two rats were randomly divided into normal control group, model group, Ningshen granula low-dose and high-dose groups (12 and 24 g/kg). The IgA nephropathy rats were established by lipopolysaccharide, bovine serum albumin and carbon tetrachloride. After the models were established, the rats of the four groups were administrated in the morning and evening on every day for consecutive 4 weeks. After the above treatment, red blood cell count of urine, 24 hours urine protein quantity, MsC apoptosis rate were detected. Expression of Bax protein of renal cortex tissue was detected by Western blot. Results: Compared with the control group, the red blood cell count of urine, 24 hours urine protein quantity, MsC apoptosis rate and the expression of Bax protein were significantly increased. Compared with the model group, the red blood cell count of urine and 24 hours urine protein quantity of the rats in Ningshen granula low-dose and high-dose groups were decreased. Compared with the model group, the MsC apoptosis rate and the expression of Bax protein in Ningshen granula high-dose group were decreased significantly. Conclusion： Ningshen granula could relieve the hematuria and albuminuria, and its mechanism may be related to up-regulation the expression of Bax protein in MsC, enhancement the apoptosis and inhibited the proliferation of MsC.

Ningshen granula；IgA nephropathy；Mesangial cells；Apoptosis

山东省中医药科技发展计划项目(2007-124)

赵 林(1981-)，男，山东济南人，主治医师，医学博士，从事肾脏、神经系统疾病的中西医结合临床与研究。

△通讯作者：李安源(1952-)，男，山东嘉祥人，主任医师，教授，博士研究生导师，从事小儿肾脏、神经系统疾病的临床与研究，Tel：0531-68776357，E-mail：sdslyy999@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)06-787-04

2017-01-06