张莉莉 吴世满 郭欢



黄芪注射液对慢性阻塞性肺疾病患者外周血Th17/Treg细胞平衡的影响及意义

张莉莉1吴世满2郭欢1

目的探讨黄芪注射液干预前后慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的比例及白介素-10(IL-10)的表达水平，及黄芪注射液对其的作用。方法收集COPD急性加重期(A组)、稳定期(B组)、肺功能正常吸烟者(C组)及肺功能正常非吸烟者(D组)各20例，分别抽取患者空腹静脉血制备单个核细胞悬液(PBMC)，分为空白组和黄芪组，应用流式细胞术检测各组黄芪注射液干预前后Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的比例及IL-10的表达水平。结果CD4+Th17细胞的比例：空白组均高于黄芪组(P<0.05)，空白组：A组(2.87±0.90)%高于B组(2.07±0.76)%、C组(1.20±0.42)%、D组(1.02±0.30)%，B组高于C、D组，C组和D组相比差异无统计学意义(P>0.05)；黄芪组：A组(1.51±0.93)%高于B组(0.94±0.65)%、C组(0.75±0.45)%、D组(0.68±0.37)%(P<0.05)，B、C、D组组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)；CD4+Treg细胞的比例：黄芪组均高于空白组(P<0.05)，在黄芪组，D组(8.04±2.65)%高于A组(4.76±1.43)%、 B组(5.89±1.93)%、C组(6.50±2.2)%(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)；在空白组，D组(6.29±3.24)%高于A组(2.42±1.45)%、 B组(4.13±1.83)%、C组(4.41±2.67)%(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)；外周血IL-10水平：黄芪组均高于空白组(P<0.05)，黄芪组：D组(7.25±1.32)%高于A组(4.76±1.31)%、 B组(6.32±1.75)%、C组(6.02±1.39)%(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)；空白组：D组(5.21±1.07)%高于A组(2.96±1.25)%、 B组(4.00±0.81)%、C组(4.31±0.90)%(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)；Th17/Treg细胞的比值：空白组均高于黄芪组(P<0.05)，黄芪组：A组(0.34±0.21)%均高于B组(0.17±0.13)%、C组(0.14±0.10)%、D组(0.11±0.07)%(P<0.05)；空白组，A组(4.27±7.77)%均高于B(0.60±0.33)%、C(0.31±0.19)%、D组(0.21±0.13)%(P<0.05)。结论Th17 /Treg 比值升高，平衡失调，可能是COPD 发病的免疫机制；黄芪注射液在一定程度上能调节Th17/Treg比例失衡，对COPD的治疗可能有一定的疗效。

肺疾病，慢性阻塞性； Th17细胞； Treg细胞； 白介素10； 黄芪注射液

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的以持续性气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关[1-2]。因肺功能进行性减退，严重影响患者的劳动力和生活质量，造成了巨大的社会和经济负担。COPD的发病除与气道和肺的特征性慢性炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激等有关外，近年来有研究者提出COPD的发生发展与Th17/Treg细胞的免疫失衡有关，COPD患者外周血中Th17细胞的增加、Treg细胞的减少或者相对增加不足导致了COPD的发生发展。刘晓君等[3]、朱成军等[4]、康彩云等[5]的研究证实了COPD患者外周血存在Th17细胞、Treg细胞的失衡。黄芪注射液是从黄芪中提取的一种非常重要的传统中药，近年来大量研究表明它有提高机体免疫功能的作用，对非特异性固有免疫、体液免疫和细胞免疫均有显著的增强作用。本研究选用COPD急性加重期、稳定期、肺功能正常吸烟和非吸烟者作为研究对象，以黄芪注射液作为干预剂，比较Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的百分比和白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)表达水平以及比值的变化，探讨Th17、Treg细胞在在COPD 发病中的作用及黄芪注射液对其的影响，为COPD的临床辅助治疗提供新的依据。

资料与方法

一、研究对象

收集2015年12月至2016年3月在山西医科大学第一医院呼吸科住院的慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者20例(A组)、呼吸科门诊就诊及随访的COPD稳定期患者20例(B组)及健康体检中心随机抽取肺功能检查正常的吸烟者(C组)和非吸烟者(D组)各20例。COPD患者均符合: ①《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2015年更新版)；②年龄在40～75岁；③急性加重表现为:短期内咳嗽、咳痰、气短或喘息症状加重，痰量增多，呈脓性或黏液脓性；④稳定期患者最近3个月内无急性加重病史。排除标准：①合并其他肺部疾病和/或其他系统感染的患者；②有风湿免疫系统疾病；③使用对本研究结果有影响的药物治疗的患者。健康组均符合：①年龄在40～75岁；②肺功能检查正常者；③近3个月未服用任何治疗药物；④吸烟者吸烟指数>200支/年；⑤体检报告提示身体健康者。所有的研究对象均签署受试者知情同意书，并经过医院伦理委员会的批准。

二、研究方法

1. 仪器及试剂：美国BD公司的流式细胞仪，美国NAPCO公司的CO2培养箱，湘仪离心机仪器有限公司的离心机，人外周血淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，细胞刺激剂、固定剂、破膜剂均购于美国BD公司，黄芪注射液购于正大青春宝药业有限公司。

2. 外周血单个核细胞悬液(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的制备：抽取研究对象空腹外周血2 ml于肝素抗凝管，PBS液等比稀释后缓慢加入装有等量淋巴细胞分离液的离心管，离心18 min(离心半径8 cm，2 000 r/min)，吸取PBMC于离心管中，PBS洗涤离心2次，制得PBMC。

3. 细胞培养：将PBMC用RPMI-1640培养液调整浓度至1×106个/ml。分别取1 ml于24孔培养板的2孔中，一孔为空白对照，加入RPMI-1640培养液320 μl、另一孔加入黄芪注射液320 μl，混匀，放入37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，后每孔分别加入细胞刺激剂2 μl，培养箱培养4 h。

4. 流式细胞术检测Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的百分比及IL-10表达水平：取空白试管加入FITC CD4抗体20 μl和培养后的PBMC 100 μl，混匀，避光20 min后PBS洗涤离心，按照说明书固定破膜，然后加PBS洗涤离心2次，重悬后加入Th17/Treg分型抗体和IL-10抗体各20 μl，避光孵育30 min，离心洗涤后加入200 μl Buffer液上机检测。

三、统计学方法

结 果

一、临床资料及肺功能比较

A、B、C、D组研究对象平均年龄无统计学意义。肺功能FEV1/FVC比较：A组和B组相比差异无统计学意义，但较C、D组有明显降低(P<0.05)；FEV1/预计值比较：D组较A、B、C组高(P<0.05)，A组和B组相比差异无统计学意义，但较C组有明显降低(P<0.05)，C组和D组相比差异无统计学意义，见表1。

表1 临床资料及肺功能

注：a与C组比较，P<0.05；b与D组比较，P<0.05

二、4组研究对象的空白组、黄芪组外周血Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的比例、Th17/Treg比值、IL-10水平结果比较

1. CD4+Th17细胞占外周血CD4+T细胞的比例：空白组均高于黄芪组(P<0.05)。在空白组，A组(2.87±0.90)高于B组(2.07±0.76)、C组(1.20±0.42)、D组(1.02±0.30)：B组高于C、D组(P<0.05)，C组和D组相比差异无统计学意义(P>0.05)；在黄芪组，A组(1.51±0.93)高于B组(0.94±0.65)、C组(0.75±0.45)、D组(0.68±0.37)(P<0.05)，其余两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2，图1。

图1 COPD急性加重期组黄芪注射液干预前后Th17细胞占外周血CD4+T细胞流式图；注：A：空白组；B：黄芪组

表2 空白组和黄芪组CD4+Th17细胞占外周血CD4+T细胞的比例的比较

注：a与A组比较，P<0.05；b与B组比较，P<0.05

2. CD4+Treg细胞占外周血CD4+T细胞的比例：黄芪组均高于空白组(P<0.05)，在黄芪组，D组(8.04±2.65)高于A组(4.76±1.43)、 B组(5.89±1.93)、C组(6.50±2.26)(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)；在空白组，D组(6.29±3.24)高于A组(2.42±1.45)、 B组(4.13±1.83)、C组(4.41±2.67)(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)，见表3、图2。

图2 COPD急性加重期组黄芪注射液干预前后(空白组和黄芪组)Treg细胞占外周血CD4+T细胞流式图；注：A：空白组；B：黄芪组

表3 空白组和黄芪组CD4+Treg细胞占外周血CD4+T细胞的比例的比较

注：a与D组相比，P<0.05；b与C组比较，P<0.05

3. Th17/Treg比值的比较：空白组均高于黄芪组(P<0.05)。在空白组，A组高于B、C、D组(P<0.05)；在黄芪组，A组高于B、C、D组(P<0.05)，见表4。

表4 空白对照组和黄芪注射液干预组Th17/Treg比值的比较

注：a与A组相比，P<0.05

三、外周血IL-10水平

黄芪组均高于空白组(P<0.05)，在黄芪组，D组高于A、 B、C组(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)；在空白组，D组高于A、 B、C组(P<0.05)，B组和C组相比差异无统计学意义，C组高于A组(P<0.05)，见表5。

表5 空白组和黄芪组IL-10的比较

注：a与D组相比，P<0.05；b与C组比较，P<0.05

讨 论

COPD可能是多种环境因素与机体自身因素长期相互作用的结果，目前发病机制尚未完全明了。多年来研究发现，COPD患者常有细胞免疫的功能异常，但一般仅以Th1/Th2细胞失衡不足解释其异常，因此近来又新提出了Th17/Treg细胞失衡学说，此机制成为了近年来研究的焦点。此外，研究发现该类患者还存在体液免疫的功能异常，免疫球蛋白水平较低，如IgG、IgA等，因而提高其免疫功能治疗需受到重视[6]。本研究以COPD患者是否存在Th17/Treg细胞失衡及黄芪注射液能否调节该失衡开展研究，探讨黄芪注射液是否可作为COPD患者的辅助治疗药物。

Th17细胞由CD4+T细胞在转化生长因子β(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、IL-6的共同诱导分化而成，IL-17是其主要效应因子。COPD急性加重的主要诱因被认为是细菌和病毒感染，发生感染时，较多的Th17细胞通过分泌IL-17作用于气道，促使中性粒细胞聚集、活化、分泌多种炎性因子(如IL-8、IL-23等)，引起气道反应性增高、肺组织弹性改变和气道重塑，促进了COPD的发生发展,也可介导其他慢性炎症和自身免疫疾病的发生[7-11]。本研究结果显示，COPD急性加重期组患者外周血Th17细胞高于稳定期组和正常组。表明COPD急性加重期Th17增高，可能参与了COPD的肺部炎症反应。Treg细胞由CD4+T细胞在TGF-β1单独诱导下分化而成，其表达受转录因子Foxp3特异性调控，可分泌抗炎因子TGF-β1正反馈调节Foxp3Treg细胞分化，IL-10是由其合成和分泌的一种重要的抑炎因子，可阻止促炎因子的分泌，抑制Th17等细胞表达炎性因子，减轻肺部炎症反应，缓解COPD患者的症状，调节T、B等细胞的分化和增殖，发挥免疫负调控作用[12-15]。本研究结果发现：COPD急性加重期组和稳定期组Treg细胞及其分泌的IL-10低于正常组，以急性加重期组更为显著。提示在COPD急性加重期Treg及IL-10减少，削弱了其抑制炎症因子分泌的作用，使肺部炎症反应放大，导致肺部较强的免疫病理损害，肺组织进一步损伤。本研究结果与黄可等[16]的研究结果相一致。

研究表明，Treg/Th17细胞失调可能是变应性鼻炎的发病机制[17]。此失衡是否也存在于COPD中目前尚未见确切报道。本研究结果显示，Th7/Treg在COPD急性加重期组显著增高，而稳定期组和正常组之间差异无统计学意义。提示急性加重期COPD患者Th17细胞过度扩增，募集较多的中性粒细胞、巨噬细胞到相应部位以清除病原体，同时它们分泌炎症介质(如中性粒细胞弹性蛋白酶等)破坏肺组织，而Treg细胞分化不足减弱了其抑制免疫应答的作用，导致了肺部持续的炎症反应，进而使患者处于较高的全身免疫反应水平状态。稳定期组患者的Th17/Treg比例低于急性加重期组，但仍高于正常组，表明稳定期患者的全身免疫反应得到缓解，仍需要通过治疗控制炎症反应。根据上述结果推测，Th17细胞比例升高，Treg细胞比例降低导致的免疫失衡可能在COPD急性加重中起重要作用，导致全身或局部促炎反应，需要通过治疗使两者达到平衡才能维持机体免疫的稳定[18]。

黄芪性味甘温，归属肺脾二经，是常用的“扶正固本、补中益气”中药之一，主要含有黄芪皂苷、黄芪多糖、胆碱及微量元素硒、铁、黄酮类似物等多种成分，现代药理研究表明它具有促进免疫、抗衰老、抗炎等作用，改善机体免疫功能的主要是黄芪皂苷，它是自然杀伤细胞、T淋巴细胞等的强力调节剂[19]。本研究以黄芪注射液为干预剂，结果显示，干预后Th17细胞的百分比较空白组都有不同程度的降低，COPD患者降低幅度较正常组大；Treg细胞百分比及IL-10都有不同程度升高，急性加重期组以Th17细胞比例占优势，稳定期组及正常组以Treg细胞比例占优势。说明黄芪注射液能抑制Th17分化，诱导Treg形成，增强和调节COPD患者T淋巴细胞的的免疫功能，从一定程度上调节了Th17/Treg细胞的失衡，这与张宏等[20-21]的研究相一致。但急性加重期存在多种因素相互作用，可导致IL-6 等分泌增多，IL-6 能抑制Foxp3的表达，一定程度上削弱了黄芪注射液对Treg细胞的诱导作用，使得急性加重患者在干预后仍以Th17细胞占优势。COPD稳定期组和正常组Th17细胞和Treg细胞的平衡未被严重破坏，经过干预后，表现出明显的抑制Th17细胞分化、诱导Treg细胞分化的效应。

王子栋等[22]的研究表明，中西医结合治疗COPD急性加重患者可以明显缓解症状，改善运动耐量，疗效肯定，安全性高。COPD的中医治疗为临床辩证分型治疗，以本虚标实立论，扶正固本与祛邪兼顾，急性期以祛邪为主，稳定期则以扶正补虚为主[23]。本研究结果表明黄芪注射液具有调节COPD急性加重期及稳定期Th17/Treg细胞失衡的作用,此结论与临床中医黄芪具有扶正祛邪的功效一致。

综上所述，Th17/Treg比值平衡对于维持机体免疫环境的稳定起着重要的作用,该比值失衡可能是COPD发病的免疫机制。黄芪注射液可调节Th17/Treg的失衡，以减轻该免疫失衡引起的炎症，达到治疗COPD患者的目的。但黄芪如何调节Th17/Treg细胞失衡的具体作用机制还有待进一步研究。

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(本文编辑：黄红稷)

张莉莉，吴世满，郭欢. 黄芪注射液对慢性阻塞性肺疾病患者外周血Th17/Treg细胞平衡的影响及意义[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(3)： 286-291.

Effect and significance of Astragalus injection on the balance of Th17/Treg cell in the peripheral blood of the patients with chronic obstructive pulmonary disease

ZhangLili1,WuShiman2,GuoHuan1.

1ShanxiMedicalUniverstiy,Taiyuan030001,China;2DepartmentofRespiration,TheFristHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China

WuShiman,Email:wushiman@163.com

Objective To investigate the percentage of Th17 cells, Treg cells in CD4+T cells and the expression level of interleukin-10 (IL-10) in the peripheral blood of the patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) before and after the interference of Astragalus Injection, to explore the effect of Astragalus Injection on them. Methods The study selected randomly 20 AECOPD patients(group A), 20 stable COPD patients (group B), 20 smokers of normal lung function (group C) and 20 non-smokers of normal lung function (group D) to collect the peripheral venous blood of them to prepare the peripheral blood mononuclear cell suspension (PBMC), then divided the PBMC of all subjects into blank group and Astragalus group, the ratio of CD4+Th17 cells, CD4+Treg cells and the expression level of IL-10 before and after the intervention of Astragalus injection were detected by flow cytometry. Results The ratio of CD4+Th17 cells: the blank groups were higher than Astragalus groups (P<0.05), group A(2.87±0.90)% was highest among the four groupsin blank groups (P<0.05), group B(2.07±0.76)% was higher than group C(1.20±0.42)% and group D (1.02±0.30)% (P<0.05), the result had no statistically significant difference between group C and group D (P>0.05); group A (1.51±0.93)% was highest among the four groups in Astragalus groups (P<0.05), the result had no statistically significant difference among the group B(0.94±0.65)%, group C(0.75±0.45)% and group D(0.68±0.37)% (P>0.05); the ratio of CD4+Treg cells: Astragalus groups were higher than blank groups (P<0.05), group D(8.04±2.65)% was highest among the four groups in Astragalus groups (P<0.05), the result had no statistically significant difference between group B(5.89±1.93)% and group C(6.50±2.26)% (P>0.05), group C was higher than group A(4.76±1.43)% (P<0.05); group D(6.29±3.24)% was highest among the four groups in blank groups(P<0.05), the result had no statistically significant difference between group B(4.13±1.83)% and group C(4.41±2.67)% (P>0.05), group C was higher than group A (2.42±1.45)% (P<0.05). The level of IL-10: Astragalus groups were higher than blank groups (P<0.05), group D(7.25±1.32)% was highest among the four groups in Astragalus groups (P<0.05), the result had no statistically significant difference between group B(6.32±1.75)% and group C(6.02±1.39)% (P>0.05), group C was higher than group A(4.76±1.31)% (P<0.05); group D(5.21±1.07)% was highest among the four groups in blank groups(P<0.05), the result had no statistically significant difference between group B(4.00±0.81)% and group C(4.31±0.90)% (P>0.05), group C was higher than group A (2.96±1.25)% (P<0.05). The ratio of Th17/Treg cells: the blank groups were higher than Astragalus groups (P<0.05), group A was highest among the four groups in Astragalus groups and blank groups(P<0.05). Conclusions The immune mechanism of COPD pathogenesis may be the ratio of Th17/Treg increased and Th17/Treg balance diaordered; to a certain extent, Astragalus injection can regulate the imbalance of Th17/Treg cells, and may have certain curative effect for the treatment of COPD.

Chronic obstructive pulmonary disease; Th17; Treg; Interleukin-10; Astragalus injection

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.009

山西省回国留学人员科研资助项目(2013-113)

030001 太原，山西医科大学1030001 太原，山西医科大学第一医院呼吸内科2

吴世满，Email: wushiman@163.com

R563

A

2016-11-13)