宋艳艳缑文斌张巍

作者单位：832000 石河子1新疆石河子大学医学院；830011 乌鲁木齐2新疆医科大学；830011 乌鲁木齐3新疆医科学第一附属医院病理科

CXCR4、PI3K和AKT在三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达

宋艳艳1缑文斌2张巍3

作者单位：832000 石河子1新疆石河子大学医学院；830011 乌鲁木齐2新疆医科大学；830011 乌鲁木齐3新疆医科学第一附属医院病理科

目的 探讨CXCR4、PI3K及AKT在三阴性乳腺癌细胞株中的表达及其相关性。方法 采用过表达CXCR4质粒pcDNA3.1-CXCR4和沉默子siRNA-CXCR4分别转染三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231，分为目的转染组和无关转染组，同时设立空白对照组。Western blot和qRT-PCR技术检测转染后CXCR4、PI3K、AKT蛋白和mRNA的表达。结果转染pcDNA3.1-CXCR4后，与空白对照组及无关转染组比较，目的转染组CXCR4、PI3K和AKT蛋白及mRNA表达水平升高（P＜0.05）；转染siRNA-CXCR4后，与空白对照组和无关转染组相比，目的转染组CXCR4、PI3K和AKT蛋白及mRNA表达水平下降（P＜0.05）。结论 在三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中CXCR4可调节PI3K及AKT的表达。

乳腺肿瘤；三阴性乳腺癌；CXCR4；pI3K激酶；AKT；表达

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤［1-2］，三阴性乳腺癌的生物学行为异于其他类型乳腺癌，具侵袭性强、预后差等特点［3］。研究表明，趋化因子CXCL12及其受体CXCR4可通过促进肿瘤血管生成、刺激肿瘤细胞迁移和增殖等调控包括乳腺癌在内的多种肿瘤的生物学行为［4-8］。PI3K-AKT信号通路是细胞内重要的信号转导通路，与致癌因子及其受体和细胞基本功能相关，是肿瘤中常见的异常激活信号通路［9-10］。Zhao等［11］研究发现，CXCL12-CXCR4生物轴可通过激活MAPK及PI3K等介导肿瘤细胞迁移。本研究拟探讨CXCR4、PI3K及AKT在三阴性乳腺癌细胞中的表达及其相关性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231由欧易生物有限公司赠与。DMEM、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购自Gibco公司，青链霉素购自Hyclone，RNA逆转录试剂盒及荧光定量MIX购自Thermo公司，凯基全蛋白提取试剂盒及凯基BCA蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。一抗CXCR4、PI3K、AKT和β-actin均购自Abcam公司，稀释度均为1∶1 000；二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。蛋白显色剂和TrizolR购自invitrogen公司，PVDF膜购自Thermo公司。pcDNA3.1-CXCR4由欧易生物有限公司合成，siRNA-CXCR4由吉玛公司合成。1.2 细胞培养及转染

三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞采用DMEM高糖培养基（含10%FBS）常规培养。待细胞生长至对数期，按每空2×106个细胞铺入6孔板中。细胞铺板培养12 h后，将含胎牛血清的DMEM完全培养基换成无胎牛血清的DMEM培养基培养4 h，然后按每孔500μL液体进行配制转染液。转染液配置：A液：5μL siRNA/pcDNA3.1+245μLOpti-MEM；B液：5μL Lip2000+245μL Opti-MEM，混匀后静置5 min，将B液加入A液中，混匀后室温下静置20min，加入6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养6 h，换成含10%FBS、1%青链霉素的DMEM完全培养基继续培养。本实验分为3组，即空白转染组、无关转染组和目的转染组。

1.3 qRT-PCR检测细胞中CXCR4、PI3K和AKTmRNA的表达

转染细胞培养48 h后，收获各组细胞，提取细胞总RNA，参照RNA逆转录试剂盒合成cDNA。引物序列如下：CXCR4-F:5'-GGCCCTAGCTTTCTTCCACT-3'，CXCR4-R:5'-GAGAGGATCTTGAGGCTGGA-3'，产物大小为126 kb；PI3K-F：5'-AAATGAAAGCTCACTCTG GATTCC-3'，PI3K-R：5'-TGTGCAATTCCTATGCAATC-3'，产物大小为100 kb；AKT-F:5'-CGAGCTGTTCTTCCAC CTGT-3'，AKT-R:5'-CCGGTACACCACGTTCTTCT-3'，产物大小为121 kb。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性10 s（40 X），50℃退火30 s（40 X），72℃延伸45 s（40 X），72℃最后延伸5min。以2-△△Ct代表各基因的相对表达量。

1.4 Western blot检测细胞中CXCR4、PI3K和AKT蛋白的表达

培养72 h后，收集各组细胞提取总蛋白，蛋白浓度定量后，按3∶1混匀蛋白提取液和4×蛋白上样缓冲液，置于PCR仪中100℃变性10min。每孔蛋白上样量为100μg。制备8%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。分离的蛋白条带电转至PVDF膜上，时间为90min。室温封闭1 h后，分别加入一抗（CXCR4、PI3K和AKT稀释度均为1∶1 000）、内参抗体β-actin（稀释度1∶1 000），4℃孵育过夜。一抗孵育后，加入二抗（稀释度为1∶1 000），室温孵育90min。显色，待出现目的条带时在凝胶成像仪上成像。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测转染后CXCR4mRNA的表达

转染pcDNA3.1-CXCR4后，目的转染组CXCR4 mRNA表达较空白转染组及无关转染组明显升高，差异有统计学意义（F=173.427，P＜0.05），见图1A；转染siRNA-CXCR4后，目的转染组CXCR4mRNA表达量较空白转染组及无关转染组明显下降，差异亦有统计学意义（F=96.314，P＜0.05），见图1B。

2.2 Western blot检测转染后CXCR4蛋白的表达

转染pcDNA3.1-CXCR4后，目的转染组CXCR4蛋白表达较空白转染组及无关转染组明显升高（F=7.402，P=0.024），见图2A；空白转染组、无关转染组及目的转染组蛋白带灰度值分别为（171.6±74.2）、（161.5±69.9）和（41.6±18.2）。转染siRNA-CXCR4后，目的转染组CXCR4蛋白表达较空白转染组及无关转染组明显下降（F=57.682，P＜0.001），见图2B；空白转染组、无关转染组及目的转染组蛋白带灰度值分别为（263.8± 23.7）、（224.5±25.3）和（421.5±25.3）。

应当说，对于轻罪范围的划定，采用法定最低刑或法定最高刑标准，抑或以某种刑罚方法为标准，都并非完全不可以。但是，由于我国《刑法》对罪名的设置具有概括性，犯罪危害程度的伸缩空间比较大，故法定最低刑的配置也较为多样，以此为标准并不太适宜。而单纯以某种刑罚方法为标准，则有可能出现轻罪范围过宽(如以有期徒刑为标准)或者过窄(如以拘役为标准)的情况。所以，我国对轻罪范围的划定，采取法定最高刑标准较为适宜，这也是学界具有普遍性的认识。

图1 转染后CXCR4 mRNA的表达

图2 转染后CXCR4蛋白的表达

2.3 qRT-PCR检测转染后PI3KmRNA的表达

转染pcDNA3.1-CXCR4后，目的转染组PI3K mRNA表达与空白转染组及无关转染组相比明显升高（F=24.765，P=0.001），见图3A；转染siRNA-CXCR4后，目的转染组PI3K mRNA表达与空白转染组及无关转染组相比明显下降（F=97.155，P＜0.001），见图3B。

2.4 Western blot检测转染后PI3K蛋白的表达

转染pcDNA3.1-CXCR4后，目的转染组PI3K蛋白的表达较空白转染组及无关转染组升高（F=8.711，P=0.017），见图4A；空白转染组、无关转染组及目的转染组的蛋白带灰度值分别为（363.9±72.9）、（353.8±75.2）、（129.7±65.6）。转染siRNA-CXCR4后，目的转染组PI3K蛋白表达较空白转染组及无关转染组下降（F=17.16，P=0.003），见图4B；空白转染组、无关转染组及目的转染组的蛋白带灰度值分别为（327.6±30.9）、（337.9± 16.7）和（508.2±47.9）。

图3 转染后PI3K mRNA的表达

图4 转染后PI3K蛋白的表达

2.5 qRT-PCR检测转染后AKTmRNA的表达

转染pcDNA3.1-CXCR4后，目的转染组AKTmRNA表达较空白转染组及无关转染组升高（F=12.313，P=0.008），见图 5A；转染siRNA-CXCR4后，目的转染组AKT mRNA表达较空白转染组及无关转染组下降（F=33.956，P=0.001），见图5B。

图5 转染后AKTm RNA的表达

2.6 Western blot检测转染后AKT蛋白的表达

转染pcDNA3.1-CXCR4后，目的转染组AKT蛋白表达较空白转染组及无关转染组升高（F=9.033，P=0.015），见图6A；空白转染组、无关转染组及目的转染组的蛋白带灰度值分别为（379.3±72.4）、（355.9±40.5）和（127.1±33.4）。转染siRNA-CXCR4后，目的转染组AKT蛋白表达较空白转染组及无关转染组下降（F=39.503，P＜0.001），见图6B；空白转染组、无关转染组及目的转染组的蛋白带灰度值分别为（331.2±37.2）、（348.5±32.6）和（536.2±32.3）。

图6 转染后AKT蛋白的表达

3 讨论

趋化因子是细胞因子超家族中具有趋化作用的分泌型小分子单链蛋白质，分子量为8～10 kDa，能激活和诱导免疫细胞，调控细胞浸润、归巢及血管形成，在炎症反应和免疫性疾病的发生发展中发挥重要作用。CXCR4是趋化因子CXCL12的受体，是一个由352个氨基酸组成的7次跨膜G蛋白偶联受体，与胞内异源三聚体G蛋白相偶联，基因定位于染色体2q21。CXCR4表达于淋巴组织、脾脏、小肠、胸腺、肝、神经元等多种正常组织，也在包括乳腺干细胞在内的多种正常组织干细胞中表达。近年研究发现，CXCR4表达与乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤的生长、血管生成和远处转移有关，是肿瘤细胞浸润及转移的重要因子和预后不良的重要指标［12-13］。三阴性乳腺癌是乳腺癌一种特殊的临床病理类型，具有侵袭性强、预后差等特点［14］。本研究通过沉默或过表达CXCR4后，观察CXCR4在三阴性乳腺癌细胞株中的表达，结果发现趋化因子受体CXCR4表达于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株中。

Rhodes等［15］研究发现，表达趋化因子受体CXCR4的肿瘤患者生存期较短，且预后不良。研究［16-17］表明，阻断CXCR4表达后，乳腺癌细胞株侵袭和转移能力显著下降、生长速度亦较慢。本研究发现，利用siRNA沉默CXCR4基因后，三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的趋化因子受体CXCR4mRNA和蛋白表达水平均下降（P＜0.05），与厉元红等［18］研究结果相一致，提示siRNA-CXCR4可能抑制三阴性乳腺癌细胞株MDAMB-231中CXCR4mRNA及蛋白的表达。

PI3K可特异性催化磷脂酰肌-3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的激酶。上游的多种刺激均可诱导PI3K活化，进而激活3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶。研究［19-20］表明，乳腺癌的各种亚型均有不同程度的PI3K信号通路激活，且该通路的激活预示着不良预后。AKT属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K直接下游信号分子，可被PI3K激活，活化后的AKT可通过诱导下游多种信号因子发挥作用，如调节细胞周期、抑制细胞凋亡、促进血管生成等［21-23］。近年研究［24-26］发现，PI3K-AKT信号通路过表达于多种肿瘤组织，如卵巢癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌等。Shen等［27］研究发现，CXCL12与CXCR4结合后，可引起G蛋白构想发生改变，从而激活PI3K/AKT信号通路而影响细胞生物学行为。基于以上观点，推测CXCR4、PI3K和AKT在三阴性乳腺癌中存在关联。为此，本研究采用siRAN和pcDNA3.1沉默或过表达CXCR4后观察三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中PI3K和AKT的表达，结果发现有效沉默CXCR4后，PI3K和AKT蛋白及mRNA的表达均下降；而有效提高CXCR4的表达后，PI3K和AKT蛋白及mRNA的表达均升高，推测在三阴性乳腺癌细胞株中CXCR4可能调节PI3K及AKT的表达，有关方面值得进一步深入研究。

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［2017-01-22收稿］［2017-02-21修回］［编辑 罗惠予］

Expression of CXCR4，PI3K and AKT in MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells

Song Yanyan1，Gou Wenbin2，Zhang Wei3（1Medical College of Shihezi University，Shihezi，832000，P.R.China；2Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，P.R.China；3Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi830011，P.R.China）

ZhangWei.E-mail：zwyhr100@163.com

Objective To explore the expression of CXC chemokine receptor-4（CXCR4），phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）and AKT in the triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231.Method MDA-MB-231 cells were transfected with pcDNA3.1 encodingCXCR4 or treatedwith siRNA againstCXCR4.qRT-PCR andWestern blottingwereused todetectmRNA and protein expression of CXCR4，PI3K and AKT.Result Transfecting cells with pcDNA3.1-CXCR4 increased mRNA and protein levels of CXCR4，PI3K and AKT（P＜0.05）；siRNA-mediated silencing of CXCR4 reduced mRNA and protein levels of CXCR4，PI3K and AKT（P＜0.05）. Conclusion CXCR4 expressionmay regulate the expression of PI3K and AKT in triple-negative breast cancer.

Breast neoplasms；Triple-negative breast cancer；CXC chemokine receptor-4；Phosphatidylinositol 3-kinase；AKT；Expression

R737.9

A

1674-5671（2017）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.02.07

张巍。E-mail：zwyhr100@163.com