叶 明，吴 辉

· 基础医学论著·

尼可地尔保护大鼠缺血再灌注心肌内质网应激机制的研究

叶 明，吴 辉

目的 观察尼可地尔对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其对内质网应激反应标志因子表达的影响。方法 48只SD大鼠随机分为6组：平衡灌注(Bal)组、平衡灌注+尼可地尔预处理(Bal+Nic100)组、缺血再灌注(I/R Ctrl)组、缺血再灌注+尼可地尔30 μmol/L预处理(Nic 30)组、缺血再灌注+尼可地尔100 μmol/L预处理(Nic 100)组、缺血再灌注+尼可地尔300 μmol/L预处理(Nic 300)组。采用Langendorff 灌流装置，建立离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，分别给予不同剂量的尼可地尔预处理。采用多道生理信号采集系统记录分析各项心功能参数：左心室收缩峰压(LVPSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp/dt max)、心率(HR)等，并计算左室发展压(LVDP=LVPSP-LVEDP)；采用LDH检测试剂盒测定冠脉流出液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性；氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测心肌梗死面积；Real-Time PCR检测心肌组织中GRP78及CHOP的mRNA表达水平；Western blot检测心肌组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平。结果 与I/R Ctrl组比较，尼可地尔预处理可显著改善大鼠离体缺血再灌注心脏的各项心功能指标。与平衡灌流期比较，I/R Ctrl组再灌注120 min后冠脉流出液中的LDH活性水平显著上升，而尼可地尔预处理各组冠脉流出液LDH活性水平显著低于I/R Ctrl 组。与I/R Ctrl组比较，尼可地尔预处理各组心肌梗死面积显著缩小。与Bal 组比较，I/R Ctrl组心肌组织中的GRP78及CHOP mRNA及蛋白表达水平显著上调，而与I/R Ctrl组比较，尼可地尔预处理可显著降低GRP78及CHOP mRNA及蛋白表达水平，且尼可地尔作用均呈剂量依赖性。结论 在大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型中，尼可地尔预处理可呈剂量依赖性地减轻心肌细胞损伤，促进缺血再灌注后心脏功能的恢复，还可抑制心肌缺血再灌注诱发的内质网应激反应。

缺血再灌注损伤；尼可地尔；心肌；左心室舒张末压；左心室等容期压力最大变化速率；心率；乳酸脱氢酶；78 kPa糖调节蛋白；C/EP源蛋白

随着经皮冠状动脉介入治疗、冠脉旁路移植术等各种血运重建技术的不断完善及多种新型抗血栓药物的应用，增强冠心病病人的治疗效果。恢复心肌血液再灌注过程中继发的心肌损伤严重减弱血运重建治疗效果，称为心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)损伤。多种机制参与心肌I/R损伤的病理生理过程，包括氧化应激、细胞内钙超载、线粒体通透性转换孔开放、炎症反应等[1]。近年来研究发现，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及其介导的细胞凋亡在心肌I/R损伤的发生发展中具有关键作用[2]。尼可地尔是临床常用的抗心绞痛药物，基础及临床研究均已证实其可有效减轻急性心肌梗死后的心肌损伤。在动脉粥样硬化小鼠模型研究中发现，尼可地尔可显著降低ERS反应标志因子78kDa糖调节蛋白(glucose regulated protein 78kDa，GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP- homologous protein，CHOP)的表达水平[3]。尼可地尔是否影响心肌I/R诱导的内质网应激及其介导的心肌细胞损伤尚不清楚。鉴于此，本研究通过建立离体大鼠心肌I/R损伤模型，观察尼可地尔预处理对缺血再灌注心肌的保护作用，及其对缺血再灌注诱发的心肌细胞凋亡及内质网应激反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性(Sprague-dawley SD)大鼠48只，8周龄，SPF级，体重250 g～280 g，分笼饲养于清洁、恒温的实验环境中，允许自由活动，自由取食饮水。将大鼠适应性喂养5 d后进行实验。采用随机数字表法将48只大鼠随机分为6组(每组8只)：平衡灌注(Bal)组，平衡灌注+尼可地尔预处理(Bal+Nic100)组，缺血再灌注(I/R Ctrl)组，缺血再灌注+尼可地尔30 μmol/L预处理(Nic 30)组，缺血再灌注+尼可地尔100 μmol/L预处理(Nic 100)组，缺血再灌注+尼可地尔300 μmol/L预处理(Nic 300)组。

1.2 主要试剂及仪器 尼可地尔(sigma-aldrich公司)、GAPDH抗体(sigma-aldrich公司)、GADD153/CHOP抗体(Abcam公司)、GRP78抗体(Abcam公司)、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)、picopure RNA提取试剂盒(Arcturus Bioscience)、Realtime PCR Master Mix(Toyobo公司)；GAPDH管家基因(Sangon公司)、PCR引物及寡核苷酸序列(Sangon公司)、凝胶成像系统(Biotop公司)、实时荧光定量PCR仪(Agilent公司)、PowerLab生理信号采集系统(AD Instruments公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立及实验方案 1 000 IU/kg体重的肝素钠经腹腔注射，20 min后经腹腔注射2%的戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。将大鼠固定于仰卧位，开胸，剪开心包，迅速将心脏取出，置于4 ℃的改良K-H液中，挤压心脏排出心腔残余血液，将多余组织修剪掉，把充满K-H液套管插进主动脉并固定好。快速连接套管至Langendorff离体灌注装置上，使用改良K-H液进行灌流。采用恒流泵维持灌流系统的灌注压在80 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)；恒温系统保持灌流液的温度为37 ℃。离体心脏平衡灌流20 min稳定跳动后，于左心房壁上切开一个小孔，取小乳胶水囊通过二尖瓣插进左心室中，采用连接导管及三通管将其与压力转换器相连。压力换能器信号经桥式放大器，输到PowerLab/8s多道生理信号采集分析系统，并采用Lab chart软件采集处理各种信号。离体心脏再经过25 min的平衡灌流后，给予持续30 min的全心缺血，即缺血(Ischemia)期，期间停止灌流，心脏浸泡在37 ℃的 K-H液中；之后恢复灌流，持续120 min，即再灌注(Reperfusion)期。尼可地尔组在缺血前分别给予不同浓度的尼可地尔(Nic 30 μmol/L，100 μmol/L，300 μmol/L)持续灌流5 min，之后以灌流液洗脱5 min，再进入缺血期及再灌注期。排除标准：平衡灌流20 min后，心率<170次/min，左心室最高收缩压<70 mmHg，或室颤持续>5 min。

1.3.2 心脏功能相关指标 连续记录整个实验过程中的各项心功能参数：左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室收缩峰压(left ventricular peak systolic pressure，LVPSP)，并计算左心室发展压(left ventricular developing pressure，LVDP)，LVDP=LVPSP-LVEDP；左心室等容期压力最大变化速率(the derivative of left ventricular pressure，±dP/dt max)、心率(heart rate，HR)。

1.3.3 冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)活性 各组于平衡灌流期及复灌120 min完成后各收集冠脉流出液2 mL。采用LDH试剂盒检测LDH的活性，按试剂盒使用说明书操作。

1.3.4 心肌梗死面积 采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测定最终心肌梗死面积。用Image J图像分析软件，分析左室心肌片总面积及梗死区面积(TTC未染区)；心肌梗死面积比=左室梗死区(未染区)面积/心肌片总面积。

1.3.5 心肌组织中的GRP78、CHOP mRNA表达水平 采用Real-Time PCR检测各组心肌组织中GRP78、CHOP mRNA表达水平。各目的基因引物均由上海生工合成(详见表1)，采用GAPDH为管家基因。

表1 各基因PCR引物信息

1.3.6 心肌组织中各种因子的表达水平 采用Western blot法检测各组心肌组织中的GRP78、CHOP的蛋白表达变化。应用Gel-Pro Analyzer 3.0软件对各蛋白条带进行定量分析。

2 结 果

2.1 尼可地尔对离体缺血再灌注心脏心功能的影响 与平衡灌流期比较，再灌注120 min后各处理组心脏的各项心功能指标：LVDP、LVEDP及± dp/dt max等明显受损(P<0.05或P<0.01)。与I/R Ctrl组比较，尼可地尔预处理可显著改善离体缺血再灌注心脏的LVDP、LVEDP、±dp/dt max、HR(P<0.05或P<0.01)。当尼可地尔剂量增加时，心功能各项指标恢复更加明显(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 尼可地尔对离体缺血再灌注心脏心功能指标的影响

2.2 尼可地尔对离体缺血再灌注心脏冠脉流出液中LDH活性水平的影响 各组大鼠离体灌流心脏平衡灌流期冠脉流出液中的LDH活性水平比较无显著差异(P>0.05)。与平衡灌流期比较，各处理组再灌注120 min后冠脉流出液中的LDH活性水平显著上升(P<0.01)；而尼可地尔预处理各组冠脉流出液中的LDH活性水平显著低于I/R Ctrl组(P<0.05或P<0.01)，随着尼可地尔剂量的增加，降低冠脉流出液中LDH活性水平的效果越明显。详见图1。

注：与I/R Ctrl组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Baseline期比较，#P<0.01，##P<0.01。

图1 尼可地尔对离体缺血再灌注心脏冠脉流出液中LDH 活性水平的影响

2.3 尼可地尔对离体缺血再灌注心脏心肌梗死面积

的影响 采用TTC染色发现，I/R Ctrl组的心肌梗死面积为(48.4±6.7)%。与I/R Ctrl组比较，提示尼可地尔预处理可显著缩小心肌梗死面积[Nic 30组(33.8±4.3)%，P<0.05；Nic 100组(25.2±3.8)%，P<0.01，Nic 300组(20.6±2.1)%，P<0.01]，随着尼可地尔剂量增加，缩小心肌梗死面积的效果越明显。详见图2。

注：与I/R Ctrl组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图2 尼可地尔对离体缺血再灌注心脏心肌梗死面积的影响

2.4 尼可地尔对离体缺血再灌注心肌GRP78及CHOP的 mRNA表达的影响 采用Real-Time PCR法分别检测各组心肌组织中GRP78及CHOP 的mRNA表达变化。结果发现，I/R Ctrl组、Nic 30组、Nic 100组、Nic 300组心肌组织中GRP78 mRNA的表达量分别是Bal 组的14.50倍、 11.92倍、6.84倍、2.25倍，CHOP mRNA的表达量分别是Bal 组的5.28倍、 3.32倍、2.15倍、2.33倍。与Bal 组比较，离体缺血再灌注心肌组织中GRP78及CHOP mRNA的表达显著上调，而尼可地尔预处理可呈剂量依赖性降低GRP78及CHOP mRNA的表达(Nic 30组与I/R Ctrl组比较，P<0.05；Nic 100组及Nic 300组与I/R Ctrl组比较，P<0.01)。提示尼可地尔预处理不影响平衡灌流离体心脏心肌组织中GRP78及CHOP mRNA的表达。详见图3。

注：图A为各组GRP78 mRNA的相对表达量比较；图B为各组CHOP mRNA的相对表达量比较。与I/R Ctrl组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Bal组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图3 尼可地尔对离体缺血再灌注心肌GRP78及CHOP mRNA表达的影响

2.5 尼可地尔离体缺血再灌注心肌CHOP及GRP78蛋白表达的影响 采用Western blot法检测ERS标志因子GRP78及促凋亡转录因子CHOP的蛋白表达变化。结果发现，与Bal组比较，缺血再灌注后心肌组织中的GRP78及CHOP蛋白表达显著上调(P<0.01)；与I/R Ctrl组比较，尼可地尔预处理各组心肌组织中的CHOP及GRP78蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。而尼可地尔预处理不影响平衡灌流离体心脏心肌组织中GRP78及CHOP的蛋白表达。详见图4。

注：与I/R Ctrl组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Bal组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图4 尼可地尔对缺血再灌注心肌CHOP及GRP78蛋白表达的影响

3 讨 论

Langendorff离体心脏灌流模型可较好地排除其他器官、体液环境及神经系统信号等因素对心脏功能的影响，揭示某种药物对不同心脏参数的潜在作用，还可精确控制给药浓度，准确判断药物的量效关系，因此研究药物对心脏的直接作用明显。目前广泛用于心血管病及药理学研究，从单一基因改变对心脏生理学的影响，到各种心肌保护措施的机制研究，均可采用这一实验模型[4-6]。本研究采用Langendorff灌流装置，建立离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，分别给予不同剂量尼可地尔预处理，验证尼可地尔对缺血再灌注心肌的保护作用、及其对缺血再灌注诱发的心肌损伤、内质网应激反应的影响。

本研究结果发现，在大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型中，尼可地尔预处理可呈剂量依赖性地促进缺血再灌注后心脏功能的恢复，减轻心肌组织损伤，缩小

心肌梗死面积，证实尼可地尔预处理可减轻心肌缺血再灌注损伤，与文献报道一致[7-9]。Horn等[10]在大鼠离体缺血再灌注模型中研究发现，尼可地尔可通过激活钾通道及促进一氧化氮释放而发挥心肌保护作用。在兔离体心脏模型中研究发现，尼可地尔在缺血之前不能改变激活恢复时间间隔(activation recovery interval，ARI)；但在缺血开始后，它能缩短ARI，并缩小心肌梗死面积达90%。线粒体KATP通道阻滞剂5-羟基奎酸盐(5-HD)可取消尼可地尔的保护效应，而不影响ARI[11]。Lu等[12]在离体大鼠心肌I/R损伤模型中研究发现，尼可地尔预处理(缺血前10 min给药)可保护心脏I/R后的左心室功能，其机制可能与开放线粒体KATP通道，减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基，增加冠脉血流有关。上述研究证实，尼可地尔的心肌保护作用可能通过激活线粒体KATP通道而实现，其机制是否涉及对内质网应激反应的影响未见文献报道。

有研究报道显示，尼可地尔可显著减少动脉粥样硬化斑块中的内质网应激反应标志物CHOP和GRP78的表达水平[3]。而本研究发现，尼可地尔可抑制心肌缺血再灌注诱发的内质网应激反应标志因子GRP78及CHOP的表达。近年来，多项研究证实缺血或再灌注可激活心肌内质网应激反应[13]。体外培养的心肌细胞模拟缺血时可诱导内质网分子伴侣GRP78及CHOP的表达增高。采用小分子干扰核糖核酸(SiRNA)抑制CHOP的表达，可减轻缺血导致的心肌细胞凋亡。这些实验结果表明ERS在缺血相关的心肌细胞损伤中具有重要作用[14]。在体外Langendorff灌流的小鼠心肌I/R损伤模型中发现，GRP78和GRP94的表达上调[15]。Zhang等[16]采用Langendorff离体大鼠心脏I/R模型研究发现，提前给予Ghrelin腹腔注射可减低心肌CHOP和caspase-12蛋白的表达水平，减轻心肌损伤和细胞凋亡，并显著改善I/R导致的心脏功能损伤；进一步在体外实验中证实，Ghrelin能直接抑制衣霉素和二硫苏糖醇诱导的培养心肌细胞的ERS反应。因此认为Ghrelin能通过抑制ERS介导的凋亡途径减轻心肌I/R损伤。可见，多种心肌保护措施可以通过抑制内质网应激反应而对缺血再灌注心肌发挥保护作用。

综上所述，本研究证实大鼠离体心肌I/R模型中，尼可地尔可呈剂量依赖性地减轻心肌缺血再灌注损伤，其机制可能与抑制内质网应激反应信号通路相关因子的表达有关。

[1] 李俊平，郭丽丽，陈中，等.冠心病再灌注治疗后的若干问题及中医药干预对策[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(9)：967-970.

[2] Glembotski CC.Endoplasmic reticulum stress in the heart[J].Circ Res，2007，101(10)：975-984.

[3] Izumiya Y，Kojima S，Kojima S，et al.Long-term use of oral nicorandil stabilizes coronary plaque in patients with stable angina pectoris[J].Atherosclerosis，2011，214：415-421.

[4] Bell RM，Mocanu MM，Yellon DM.Retrograde heart perfusion：the langendorff technique of isolated heart perfusion[J].J Mol Cell Cardiol，2011，50(6)：940-950.

[5] 梁伟涛，臧旺福.离体心脏Langendorff灌流模型稳定性的探讨[J].国际心血管病杂志，2011，38(1)：44-47.

[6] Skrzypiec-Spring M，Grotthus B，Szelag A，et al.Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium[J].J Pharmacol Toxicol Methods，2007，55(2)：113-126.

[7] Watanabe N，Akasaka T，Fujimoto K，et al.Effect of nicorandil，a K+ATP -channel opener，on coronary capillary architecture and volume after early myocardial ischemia-reperfusion--a 3-dimensional confocal laser microscopic study[J].Circ J，2004，68(12)：1210-1214.

[8] Nagata K，Obata K，Odashima M，et al.Nicorandil inhibits oxidative stress-induced apoptosis in cardiac myocytes through activation of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels and a nitrate-like effect[J].J Mol Cell Cardiol，2003，35(12)：1505-1512.

[9] Terai K，Hiramoto Y，Masaki M，et al.AMP-activated protein kinase protects cardiomyocytes against hypoxic injury through attenuation of endoplasmic reticulum stress[J].Mol Cell Biol，2005，25(21)：9554-9575.

[10] Horn M，Hügel S，Schroeder M，et al.Mechanisms of the effects of nicorandil in the isolated rat heart during ischemia and reperfusion：a 31P-nuclear magnetic resonance study[J].J Cardiovasc Magn Reson，2001，3(4)：349-360.

[11] Tsuchida A，Miura T，Tanno M，et al.Infarct size limitation by nicorandil：roles of mitochondrial K(ATP)channels，sarcolemmal K(ATP)channels，and protein kinase C[J].J Am Coll Cardiol，2002，40(8)：1523-1530.

[12] Lu C， Minatoguchi S，Arai M，et al.Nicorandil improves post-ischemic myocardial dysfunction in association with opening the mitochondrial K(ATP)channels and decreasing hydroxyl radicals in isolated rat hearts[J].Circ J，2006，70(12)：1650-1654.

[13] Azfer A，Niu J，Rogers L，et al.Activation of endoplasmic reticulum stress response during the development of ischemic heart disease[J].Am J Physiol，2006，291：1411-1420.

[14] Akao M，Teshima Y，Marbán E.Antiapoptotic effect of nicorandil mediated by mitochondrial ATP-sensitive potassium channels in cultured cardiac myocytes[J].J Am Coll Cardiol，2002，40(4)：803-810.

[15] Martindale J，Fernandez R，Thuerauf D，et al.Endoplasmic reticulum stress gene induction and protection from ischemia/reperfusion injury in the hearts of transgenic mice with a tamoxifen-regulated form of ATF6[J].Circ Res，2006，98，1186-1193.

[16] Zhang GG，Teng X，Liu Y，et al.Inhibition of endoplasm reticulum stress by ghrelin protects against ischemia/reperfusion injury in heart[J].Peptides，2009，30：1109-1116.

(本文编辑薛妮)

Nicorandil Protect the Myocardium from Ischemia Reperfusion Injury through Inhibiting Endoplasmic Reticulum Stress in Rats

Ye Ming，Wu Hui

The First College of Clinical Medical Sciences，China Three Gorges University，Yichang 443003，Hubei，China；Corresponding Author：Wu Hui，Yichang Central People’s Hospital，Yichang，Hubei，China

Objective To observe the effect of nicorandil preconditioning on rat in vitro myocardial ischemia reperfusion(I/R)injury and the expression of the key factors in endoplasmic reticulum stress signal pathway.Methods Forty-eight Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into six groups：balance group，balance+100 μmol/L nicorandil preconditioning group，I/R control group，30 μmol/L nicorandil preconditioning group，100 μmol/L nicorandil preconditioning group and 300 μmol/L nicorandil preconditioning group.Hearts from each group were excised and subjected to 30 min global ischemia followed by 120 min reperfusion in a Langendorff apparatus.Homodynamic parameters of left ventricular (LV) were recorded and evaluated with Powerlab system，including LV developed pressure (LVDP)，LV end-diastolic pressure (LVEDP)，and the derivative of left ventricular(+dP/dtmax and -dP/dtmax).Cell death was reflected by lactate dehydrogenase (LDH) activity assay in coronary effluent.Cardiac infarct size was also measured after nicorandil treatment by Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) staining.The mRNA levels of ER stress markers，including glucose-regulated protein (GRP) 78 and C/-EBP homologous protein (CHOP) were examined by real time-PCR.The protein expressions of GRP78 and CHOP were detected by western blot.Results Nicorandil preconditioning improved post-ischemic cardiac function of isolated rat heart in a concentration dependent manner，and reduced LDH activity in coronary effluent.Consistent with the above observation，nicorandil preconditioning significantly reduced the infarct size after ischemia reperfusion.The mRNA level and protein expression of GRP78 and CHOP were upregulated in I/R heart.When the I/R hearts were treated with nicorandil，both CHOP and GRP78 levels were significantly attenuated，which emerged in an dose-dependent way.Conclusion Nicorandil preconditioning could alleviate myocardial I/R injury，ameliorate post-ischemic contractile function recovery，and inhibit endoplasmic reticulum stress induced by myocardial I/R in a dose-dependent manner in vivo.

ischemia reperfusion injury；nicorandil；myocardium； left ventricular developed pressure； left ventricular end-diastolic pressure； the derivative of left ventricular；heart rate；lactate dehydrogenase； glucose-regulated protein 78； C/-EBP homologous protein

湖北省自然科学基金项目(No.2015CFB286)

三峡大学第一临床医学院/湖北省宜昌市中心人民医院(湖北宜昌 443003)

吴辉，E-mail：cardiology_wh@126.com

信息：叶明，吴辉.尼可地尔保护大鼠缺血再灌注心肌内质网应激机制的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(11)：1310-1314.

R542.2 R256

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.11.007

1672-1349(2017)11-1310-05

2017-01-25)