郭泓利++周小红++张岩++施汉昌

摘 要：近年来，具有高亲和性和特异性的免疫反应在生物化学分析、食品安全和环境监测领域得到越来越广泛的应用，抗体-抗原亲和反应分析方法的研究显得尤为重要。本文基于平面波导生物传感器，研究芯片界面抗体-抗原间的相互作用。通过共价结合将包被抗原结合在芯片表面，制备了可重复使用20次的免疫芯片，研究芯片表面的免疫反应动力学，建立芯片表面的荧光免疫动力学方程，获得了相应的免疫亲和参数。

关键词：平面波导；荧光免疫；动力学分析；抗体-抗原反应

0 引言

近年来，具有高亲和性和特异性的免疫反应在医学诊断、生物化学分析、食品安全和环境监测领域得到越来越广泛的应用[1，2]，抗体-抗原亲和反应的定性或定量分析方法的研究显得尤为重要。传统的分析方法有热量测定法、电泳分析法、超速离心分析法，但这些方法仅适用于低通量分析，且结果分辨率较差。为了克服传统方法的缺点，光学生物传感器开始应用于免疫反应动力学研究，如SPR[3]、BLI[4，5]、光波导生物传感器[6]，这些技术可以实现实时的动力学反应数据分析，并且更加快速和灵敏[7-11]。

本文基于平面波导生物传感器建立了一种分析芯片界面抗体-抗原免疫反应动力学的方法。该方法研究了芯片表面包被抗原与溶液中单克隆抗体的免疫反应，并得到了芯片界面免疫反应的结合速率、解离速率和亲和常数。本文主要选取了三聚氰胺、黄曲霉素M1、磺胺二甲嘧啶和双酚A这四种物质的单克隆抗体-抗原反应作为研究对象，研究了在芯片界面的免疫反应动力学，为基于免疫反应的检测研究提供了数据支持和理论依据。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

试验中使用的材料主要包括如下：BSA（Sigma），三聚氰胺（Mel）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、双酚A（BPA）和黄曲霉四M1（AFM1）单克隆抗体，BSA-Mel，BSA-AFM1，BSA-BPA，BSA-SM2，GMBS（Sigma），Cy5.5-NHS（GE），MTS（Sigma），10mM PBS，100mM PBS，H2SO4，30%H2O2，SDS，HCl，NaOH。

1.2 免疫芯片的制備

本试验利用MTS和GMBS在芯片表面固定包被抗原。反应流程如图1所示。主要步骤如下：a.芯片表面羟基化[12]：将干净的芯片浸泡在piranha溶液中（浓H2SO4/ 30%H2O2体积比为3：1），在110℃下反应60min；b.芯片表面硅烷化：用无水甲苯配置2%的MTS溶液，将芯片置于其中反应2个小时；c.引入偶联基团：首先将芯片置于无水乙醇配置的2mM的GMBS溶液中，反应1个小时；d.包被抗原的固定：将15μl0.5mg/ml被抗原滴在芯片的全反射位点上。在温度为4℃的条件下反应12小时后，用超纯水清洗残留包被抗原，随后用2mg/ml的BSA溶液封闭芯片表面未反应的活性基团。未测验时，免疫芯片保存于4℃冰箱，保持芯片表面清洁。

1.3 平面波导生物传感器

本研究组自主研发了平面波导生物传感器，该传感器主要基于倏逝波和全内反射荧光原理（TIRF）[13，14]，利用全内反射产生的倏逝波激发芯片表面数百纳米薄层内的荧光基团，从而产生荧光信号，传感器采用光纤收集荧光信号，再通过光电转换器将荧光信号转换为电信号，从而实现定量分析。利用平面波导生物传感器定量分析目标物质，就必须设计巧妙的方法将目标物质的浓度与荧光信号的强弱建立正相关或者负相关的关系。

该生物传感器主要由传感元件、自动进样系统、光学分析系统和信号处理系统4个部分组成，如图2所示。

1.4 实验方法

将固定了BSA-Mel、BSA-BPA、BSA-SM2和BSA-AFM1的生物芯片置于平面波导生物传感器的反应池。所有反应都在10mM PBS缓冲体系中进行。为了获得动力学结合数据，通入不同浓度的抗体混合液（含有Ab-Mel-Cy5.5、Ab-AFM1-Cy5.5、Ab-SM2-Cy5.5和Ab-BPA-Cy5.5四种标记荧光的抗体）与芯片反应，获得不同时间条件下的信号强度。每次反应结束后，用0.5% SDS（pH为1.9）的缓冲溶液打断抗体和芯片表面抗原之间的化学键，同时保持芯片表面抗原的活性，实现芯片的重复使用，节省成本的同时，还能保证结果的一致性。

1.5 反应动力学和亲和性分析

抗体和抗原的特异性主要由抗原决定簇的空间位置决定。抗体在任何一个系统中都有一个有限的亲和性，可用解离常数KD（单位为M）来表示，KD是解离速率（kd，s-1）与结合速率（ka，M-1s-1）的比值[15，16]：

KD=kd/ka （1）

抗体与抗原的反应关系可用以下的关系式来表示：

（2）

其中，AgAb*表示抗体-抗原复合物，Ab* 表示荧光标记的抗体，Ag表示抗原。由于芯片表面质量平衡，芯片界面免疫复合物的浓度变化速率可以表示为：

（3）

其中，[Ag]指抗原的浓度（M），[Ab*]指荧光标记的抗体浓度（M）， 代表抗体-抗原复合物浓度的变化速率（M-1s-1）。

基于平面波导生物传感器的检测原理，抗体-抗原复合物的浓度与荧光信号强弱成正相关，因此我们可以得到荧光信号变化速率与抗体浓度、结合速率、解离速率等有关的关系式：

（4）

积分后可得以下关系式：

（5）

其中， 是Cy5.5-抗体的初始浓度，Rt是任意t时刻的响应信号，Rmax是最大的响应信号值。

将实验数据进行积分拟合，获得相应的动力学关系式和相应参数，每个响应值R都被重复测量3次，取其平均值用于计算模拟。

2 实验结果与讨论

2.1 芯片界面的荧光免疫反应

将芯免疫片置于平面波导生物传感器的反应池中，通入不同浓度的抗体混合液，记录不同时间下的响应信号。图3为不同浓度的四种抗体与芯片表面抗原的随时间变化的结合曲线。当抗体浓度过大或者过小时，信号不会随时间的变化发生明显的变化。高浓度时，结合反应容易更快地达到平衡，低浓度时，则需要更长的时间来达到平衡。因此实际反应时，浓度的选择不可以太低，但是浓度也不宜太高，太高会大大提高检测的成本。

2.2 动力学和亲和力分析结果

为了计算抗体-抗原免疫反应动力学参数，首先要剔除检测结果中的一些异常值。为了获得芯片表面免疫反应的动力学参数ka和kd，同样需要确定Rmax值。通过改变抗体浓度，测定平衡时间（t为600s）的信号强度，然后通过Logistic拟合可获得理论Rmax值，如图4所示。当芯片表面BSA-Ags为0.5mg/ml时，黄曲霉素M1、双酚A、三聚氰胺和磺胺二甲嘧啶抗体与芯片反应可以得到的最大理论响应值Rmax分别为23228m.v、45445m.v、15424m.v和15770 m.v。

获得Rmax后，将图3的结合结果除以相应的Rmax值，可以得到不同浓度条件下芯片界面免疫反应的结合率（Binding%）随时间的变化，如图5所示。结合率为每点的荧光强度与理论拟合得到的反应平衡时最大荧光强度Rmax的比值，由图中结果可知，反应时间相同，分析物浓度越大，反应达到平衡所需时间越短。

用SPR分析研究免疫动力学时发现，当平衡时的结合率为100%时，此时使用的初始抗体浓度通常为100KD；当平衡时的结合率为50%时，此时使用的初始抗体浓度通常为KD；当平衡时的结合率接近于0时，此时使用的初始抗体浓度通常为0.1KD。根据此经验，并且结合图5，可以迅速选择合适的抗体浓度用于检测。

随后对结果进行积分拟合，得到类似于公式5的关系式：

（6）

（7）

（8）

表1总结了各个免疫反应的参数A、B和动力学参数ka，kd，KD。Ab-AFM1、Ab-BPA、Ab-Mel和Ab-SM2四种抗体在芯片界面的免疫反应结合速率ka分别为0.37×106 M-1s-1，3.36×106M-1s-1，1.09×106M-1s-1和5.19×106 M-1s-1。四种抗体的芯片界面免疫反应解离速率kd分别为0.30×10-3s-1，4.74×10-3s-1和3.60×10-3s-1和1.01×10-3s-1。而其免疫解离常数KD则分别为0.81nM，1.10nM，3.40nM和1.01nM。可见，Ab-AFM1的亲和力最好，Ab-Mel的亲和力最差。

表2比较了用平面波导生物传感器与ELISA测量的动力学参数KD，平面波导测定的KD值都高于ELISA测定值。分析可能原因主要是本次试验测定的抗体都为荧光标记后的抗体，荧光标记过程会对抗体的亲和性产生影响，而ELISA测定的抗体无需标记荧光染料。

2.3 芯片界面免疫反应的重复性能分析

免疫芯片的稳定性和重复性是影响检测的重要指标。由于目标物质通常为小分子，很难直接被固定到芯片上，因此通常将包被抗原作为识别分子共价结合到芯片表面，包被抗原相对于小分子生物特性、化学结构更加稳定。为了实现芯片的重复使用，在每一次检测结束后，采用0.5%的SDS（pH为1.9）溶液清洗芯片表面，使抗体-抗原复合物解离，却不会破坏芯片表面包被抗原的活性。

从图6结果可以发现，Ab-Mel结合信号为7363m.v，20次反应测量结果的相对标准偏差（R.S.D.）为2.79%；Ab-BPA結合信号为20496m.v，20次反应测量结果的相对标准偏差（R.S.D.）为3.44%；Ab-AFM1结合信号为14386m.v，20次反应测量结果的相对标准偏差（R.S.D.）为3.25%；Ab-SM2结合信号为7631m.v，20次反应测量结果的相对标准偏差（R.S.D.）为4.33%。测试结果表明免疫芯片至少可以测试20次以上，并且保证没有明显的信号变化（变化在5%以内）。

3 结论

本文基于平面波导生物传感器研究了芯片界面的抗体-抗原这类具有高亲和力的生物反应间的相互作用。通过共价结合将包被抗原结合在芯片表面，制备了可重复使用20次的免疫芯片，通过荧光信号将物质浓度转化为电信号，成功地测得了浓度数据。基于理论动力学方程，提出了适用于平面波导生物传感器的动力学反应方程及其数据分析方法，成功地获得了黄曲霉素M1、三聚氰胺、双酚A和磺胺二甲嘧啶四种乳品中常见污染物的抗体-抗原免疫反应动力学参数，其KD分别为0.81nM，3.40nM，1.10nM和1.01nM；ka分别为0.37×106M-1s-1，1.09×106M-1s-1，3.36×106M-1s-1和5.19×106M-1s-1；kd分别为0.30×10-3s-1，3.60×10-3s-1，4.74×10-3s-1和5.25×10-3 s-1。研究结果将有助于更好地了解芯片界面免疫反应的动态过程，为实际检测提供理论依据和数据支持。

[基金项目] 科技部重大科学仪器开发专项2012YQ030111