李文畅，张桂贤，刘大卫，赵秀梅，张 一，刘洪斌

嘌呤能2X7受体-核苷酸结合寡聚化结构域样受体3信号通路活化在慢性胰腺炎纤维化中的作用

李文畅1，张桂贤1，刘大卫1，赵秀梅1，张 一2，刘洪斌1

目的：探讨嘌呤能2X7受体（P2X7R）-核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎性体信号通路在小鼠慢性胰腺炎模型胰腺纤维化进程中的作用。方法：通过反复腹腔注射雨蛙素造成小鼠慢性胰腺炎模型,分别用P2X7R拮抗剂氧化三磷酸腺苷（OxATP）和亮蓝G（BBG）进行干预，处死后观察胰腺组织病理学变化，并用Western Blot及RT-PCR法对P2X7R、NLRP3和半胱天冬酶1（caspase-1）的含量进行检测，比较各组的变化。结果：正常对照组的P2X7R、NLRP3和caspase-1的蛋白表达水平分别为0.85±0.18,、0.93±0.16和1.02±0.06，模型组分别是1.55±0.22、2.00±0.35和2.23±0.56，二组比较，均有差异。OxATP组分别为1.02±0.26、1.01±0.09和0.95±0.04，BBG组分别为0.97±0.17、0.96±0.14和2.07±0.33，与模型组相比，无论是OxATP组还是BBG组，P2X7R、NLRP3和caspase-1在胰腺组织中的表达均显著降低（P＜0.05）。病理结果显示，模型组出现了明显的胰腺纤维化，而OxATP组和BBG组的慢性胰腺炎和纤维化指标明显改善。结论：OxATP和BBG能够降低慢性胰腺炎模型的慢性炎症和纤维化程度，其机制与抑制P2X7R-NLRP3-caspase1信号通路的活化有关。

慢性胰腺炎；胰腺纤维化；嘌呤能2X7受体；核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎性体

胰腺纤维化是多种慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）的共同组织病理学特征，但其发病机制迄今为止还未明确[1]。多数研究者普遍认为，胰腺纤维化是由胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells, PSCs）激活引起的[2-3]。嘌呤能2X7受体（purinergic 2X receptor 7,P2X7R）作为一个关键调控元件，监控细胞损伤导致的ATP等分子释放激活胞内核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3 inflammasome,NLRP3）炎症小体，在信号级联反应中受到了特别的重视[4-5]。然而，P2X7R在CP及其纤维化进程中发挥的作用尚未见报道。我们利用小鼠CP模型进行了一系列研究，探讨了P2X7R拮抗剂对胰腺纤维化及其下游NLRP3炎性体活化的阻断作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级健康雄性C57BL/6小鼠40只，体质量20～25 g（6周龄）。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号SCXK（京）2012-0001，批号11400700097218。实验前进行适应性喂养1周，于动物中心屏障级动物室内饲养（许可证号SYXK(津)2011-0003），每笼5只。饲喂普通大、小鼠生长维持颗粒饲料，饮水则给予纯净水。整个实验过程中，动物自由摄食、饮水，12 h/d交替照明，室温（23±2）℃，相对湿度（55±5）%。

1.2 主要试剂及仪器设备 试验样品与试剂：雨蛙素、氧化三磷酸腺苷（oxidized ATP,OxATP）及亮蓝G（brilliant blue G,BBG），均购自Sigma公司；天狼星红及天青石蓝液购自FLuka公司；所需抗体均购自Santa Cruz公司，主要包括羊多克隆抗体anti-p2x7r、兔多克隆anti-nlrp3、山羊多克隆抗半胱天冬酶1（caspase-1）。

仪器：DM4000B型研究级显微镜、RM2235/ 2245型切片机、ASP300全自动组织脱水机及DM750P型偏振光显微镜均为德国Leica公司产品。

1.3 方案 CP小鼠模型是由反复腹腔注射胆囊收缩素类似物雨蛙素诱发。40只小鼠，随机分为4组（每组10只）。正常对照组在整个的8周研究期间里，处理方式为腹腔注射生理盐水；1～6周时，CP模型组、OxATP组和BBG组按实验方案注射雨蛙素（CP诱导剂），单次注射剂量为50 μg/kg，1次/h，6次/d，每周一、三、五注射，连续6周[6]；7～8周时CP模型组腹腔注射生理盐水，OxATP组腹腔注射OxATP（200 μL, 30 μM），BBG组腹腔注射BBG（200 μL，1 μM）。实验结束，颈椎脱臼处死所有动物，迅速剪取胰腺，一部分迅速至于液氮中冷冻，剩余胰腺组织10%甲醛固定、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色（HE染色）后进行组织学分级以及免疫组化染色。

1.4 胰腺纤维化的组织学检查及定量分析 将福尔马林固定过的胰腺组织进行石蜡包埋，4 μm切片。一部分组织切片按标准方法进行HE染色。CP损伤的严重程度，由病理医师采用盲法，在未知分组的情况下，对胰腺器官标本的炎性细胞浸润、腺泡萎缩及纤维化程度进行评分。评分分级方法：炎症细胞浸润（0，无；1，＜5%；2，＜10%；3，＜50%；4，≥50%），腺泡萎缩（0，无；1，较少；2，中度；3，较多或严重），纤维化（0，无；2，有限的区域内；4，弥漫性）。对于所有的参数，随机选取了每只鼠胰腺的任意三个部位作为标本，并随机选取每个组织切片中10个不同的微视野进行了检查。

另取部分组织切片用苦味酸-天狼星红进行染色，以评估胰腺组织胶原含量。切片进行脱蜡处理后，用0.1%（W/V）天狼星红饱和苦味酸溶液在室温下染色1 h。而后用蒸馏水冲洗除去浮色、Mayer苏木精复染和1%盐酸分化，自来水碱化后脱水并封片。苦味酸天狼星红染色后的切片在偏振光显微镜100倍率下进行观察，通过偏光颜色的差异对胰腺组织胶原纤维的病变程度进行分析。并通过α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）染色使用ABC试剂盒（Vector aboratories）检测胰腺组织中PSCs的活化。

1.5 Western Blot法检测胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase-1蛋白水平表达 将胰腺组织匀浆所提蛋白经10%SDS-PAGE进行电泳，并且转膜、封闭、加一抗孵育（一抗稀释度分别是P2X7R为1∶200、NLRP3为1∶500、Caspase1为1∶1000），4℃过夜；次日加入二抗孵育，二抗稀释度均为1：10000，室温孵育1.5 h；洗膜后加入ECL发光液显色，结果用Quantity One分析P2X7R、NLRP3和Caspase1的灰度值，并以GAPDH作为内参进行比较。

1.6 胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase1的RT-PCR反应 以Trizol试剂(Invitrogen,USA)，从冷冻的胰腺组织中提取总RNA。通过测量260和280 nm处的吸光度来验证核酸的数量和纯度。用TaqMan®反转录试剂进行逆转录(Applied Biosystems,USA)。扩增在Icycler热循环仪进行（Bio-Rad）。实时聚合酶链反应法检测mRNA的表达水平。实时定量聚合酶链反应所需的转录引物序列如表1所示。阈值循环数测定采用iCycler软件1.0版本（Bio-Rad）。通过熔融曲线对扩增产物进行验证。以GAPDH作为内参基因用2-ΔΔCT方法对每个基因mRNA的相对丰度变化进行计算。

表1 实时荧光定量PCR扩增反应所需引物序列

1.6 统计分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，符合正态分布的计量资料以(±s)表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验。P＜0.05时，认为有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺慢性炎性损伤病理组织学检查 与正常对照组比，CP模型小鼠（8周）胰腺慢性炎症损伤显著，表现为结构异常、腺泡萎缩、纤维化和炎性细胞浸润（见表2及图1A）（均P＜0.05）。经OxATP或BBG治疗后，胰腺慢性炎症损伤均明显减轻（表2及图1）。

表2 小鼠胰腺病理组织学评分比较(±s，n=10，分)

表2 小鼠胰腺病理组织学评分比较(±s，n=10，分)

注：与正常对照组比较，aP＜0.01，与CP模型组比较，bP＜0.05

组别正常对照组CP模型组OxATP治疗组BBG治疗组炎细胞浸润0 3.49±0.31a2.34±0.28a、b2.52±0.29a、b腺泡萎缩0 2.84±0.36a1.81±0.34a、b1.90±0.33a、b纤维化0 3.27±0.42a2.19±0.36a、b2.03±0.37a、b

图1 P2X7R拮抗剂OxATP及BBG治疗后胰腺损伤及纤维化程度评估

2.2 胰腺纤维化改变 与正常组比较，CP模型小鼠胰腺出现了显著纤维化，且胶原纤维主要集中在胰腺的导管和血管的周围，而在OxATP组和BBG组小鼠胰腺纤维化均明显减轻（图1）。

采用苦味酸天狼星红染色法对胰腺中的胶原含量进行定量分析。在偏振光照射下，I型胶原蛋白显示为黄红色，Ⅲ型胶原显示为绿色（图1C）。用Image-Pro Plus 6图像分析软件（Media Cybernetics， MD，USA）在同一个图像中，通过量化不同的颜色、分布可以对两种类型胶原蛋白的成熟度和胶原容积分数（CVFS）进行计算。CVFS是间质胶原染色区除以整个组织的总和。计算公式：CVFS=(绿色胶原面积+黄红色胶原面积)/总面积。选取三个不同的胰腺组织区域进行检查，以减少抽样误差。定量分析结果表明，CP模型组胶原含量明显增加，并且以I型胶原蛋白（黄红色）为主，Ⅲ型胶原蛋白含量相对较少。在OxATP组和BBG组小鼠胰腺CVFS明显减轻（图1B、1C），也是以I型胶原蛋白（黄红色）为主。

用α-SMA免疫组化染色对激活的PSCs进行定量分析，该细胞是目前认为在胰腺纤维化过程中起主导作用的细胞。在CP诱导下，PSCs明显增多，而经OxATP和BBG治疗后，PSCs随之减少（图1D）。

2.3 胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase-1在蛋白表达水平比较 与对照组相比较，模型组动物P2X7R，NLRP3和Caspase-1三种蛋白的表达量均显著增高。与模型组相比较，OxATP组和BBG组小鼠胰腺中三种蛋白表达量均明显下降（见图2及表3）。

图2 P2X7R，NLRP3和Caspase-1蛋白在各组小鼠胰腺中的表达

表3 P2X7R、NLRP3和Caspase-1蛋白在各组小鼠胰腺中的表达(±s，n=10)

表3 P2X7R、NLRP3和Caspase-1蛋白在各组小鼠胰腺中的表达(±s，n=10)

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

正常对照组CP模型组OxATP治疗组BBG治疗组P2X7R/GAPDH 0.85±0.18 1.55±0.22a1.02±0.26b0.97±0.17bNLRP3/GAPDH 0.93±0.16 2.00±0.35a1.01±0.09b0.96±0.14bCaspase-1/GAPDH 1.02±0.06 2.23±0.56a0.95±0.04b2.07±0.33a、b

2.4 胰腺中P2X7R、NLRP3和caspase-1在基因水平表达 用RT-PCR法对正常对照组、模型组以及P2X7R拮抗剂治疗组小鼠胰腺中P2X7R、NLRP3和Caspase-1 mRNA转录水平的表达进行检测及分析。CP模型组在反复雨蛙素注射的诱导下，P2X7R、NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达显著增加。与CP模型组相比，OxATP和BBG治疗组，P2X7R、NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达均显著降低（图3）。

3 讨论

胰腺纤维化是各种原因所致CP的共同特征，同时也是与其伴随的组织病理学特点，表现为大量成纤维细胞增生和细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）在胰腺内沉积[7-8]，导致胰腺实质纤维化、胰腺组织丧失、腺泡细胞萎缩、胰管狭窄或扩张、胰管结石以及炎症细胞浸润等后果。NLRP3炎症小体是目前研究得最多的一种炎症小体，不仅能被许多细菌、病毒等病原体所激活，同时也能被体内自身产生的“危险信号”激活。当细胞受到损伤而发生坏死时，细胞中的ATP等分子会释放到胞外，ATP激活其细胞表面受体P2X7后，能够打开其介导的离子通道，使钾离子外流，并能够通过胞外的Pannexin-1在细胞膜形成小孔，一些NLRP3的配体通过小孔进入细胞内激活NLRP3炎症小体[9-10]。P2X7R作为一种危险信号“传感器”，充当了监测ATP释放的报警信号，在器官纤维化中发挥了重要作用，如肺纤维化，肾间质纤维化和肝纤维化等[11-12]。

图3 各组小鼠胰腺中P2X7R，NLRP3和Caspase-1 mRNA的相对表达量(±s，n=10)

CP是由于各种原因引起的以胰腺细胞破坏、进行性纤维化为主的病变。研究发现，不同病因所致的CP虽然起始步骤各异，但病理学改变相似，即持续进展的慢性炎症最终导致胰腺腺泡和胰岛细胞出现不可逆性损害，并逐渐被纤维组织所取代，致使胰腺内、外分泌功能显著障碍，严重影响患者的生活质量。胰腺纤维化已被视为各种原因所致CP的共同病理学特征，是CP病程中的核心事件及防治的关键靶标。

最近，P2X7R-NLRP3炎性体信号通路作为参与组织或器官纤维化的一个关键调控元件而备受关注。本研究首先利用雨蛙素反复注射造成小鼠胰腺组织腺泡萎缩，组织中出现炎性细胞浸润，胶原含量和PSCs细胞明显增多，从而成功构建了小鼠CP模型，对模型组胰腺中P2X7R，NLRP3和Caspase-1的基因和蛋白表达水平进行分析，三者的表达均较正常对照组小鼠有明显增多。这与目前对P2X7R在肺纤维化中的基础研究亦或临床研究的报道相互印证，细胞外ATP可能作为一个危险信号，能够通过激活肺泡巨噬细胞表面P2X7受体引起肺组织炎症和纤维化[13-14]。

为进一步确定P2X7R、NLRP3和Caspase-1在CP过程中的作用，我们选用了两种P2X7R拮抗剂—OxATP和BBG作为工具药进行试验。结果显示，与CP模型组相比使用两种工具药阻断P2X7R后，HE染色的纤维化评分、天狼猩红染色和α-SMA免疫组化染色后组织病变程度均明显改善，表明胰腺慢性炎症和纤维化程度明显减轻，且其纤维化改善与P2X7R、NLRP3和Caspase-1在组织中的表达呈现出一定的相关性。有研究人员用二氧化硅诱发小鼠肺纤维化模型后，将暴露于二氧化硅的P2X7受体进行基因敲除，其结果不仅减轻了肺部炎症和纤维化，同时也降低了肺功能损害[15]。这种相关性在肝纤维化、肾纤维化和心肌纤维化中也有详细的报道[16-18]。

综上所述，我们推测此过程可能与CP模型产生损伤时腺泡细胞破坏，胞外ATP引起P2X7R活化，进而级联激活NLRP3通路有关。NLRP3炎性体的活化又为后续caspase-1激活多种炎性细胞因子提供了基础。这些证据为P2X7R及NLRP3炎性体的激活在CP纤维化进程中的重要性提出了新的见解。相信在不久的将来，阻断P2X7R或许可以成为一种CP治疗新的思路，在防止胰腺纤维化方面的发挥作用。

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（收稿：2016-08-16 修回：2017-03-08）

（责任编辑 王 丰）

Role of Purinergic 2X7 Receptor-Nucleotide-binding Oligomerization Domain Receptor 3 Signal Path⁃way Activation in the Fibrosis of Chronic Pancreatitis

LI Wen-chang，ZHANG Gui-xian，LIU Da-wei，et al.
Tianjin Institute of Medical and Pharmacological Sciences,Tianjin(300020),China

Objective To investigate the role of purinergic 2X7 receptor(P2X7R)-NLRP3 signaling path⁃ way in the process of pancreatic fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis.MethodsChronic pancre⁃atitis model was induced by repeated intraperitoneal injections of caerulein.The P2X7R antagonists OxATP and (brilliant blue G,BBG)were given to respective groups.Then,all mice were sacrificed and the histopathological changes of the pancreas，especially the fibrotic degrees，were observed.Caspase-1,NLRP3 and P2X7R were de⁃tected by Western Blot and RT-PCR and compared among the groups.ResultsThe protein expression levels of P2X7R,NLRP3 and caspase1 in the normal control group were 0.85±0.18,0.93±0.16 and 1.02±0.06,while 1.55±0.22,2.00±0.35 and 2.23±0.56 in the model group.Significant differences were found in these parameters as compared to control values.The respective values for these parameters were 1.02±0.26,1.01±0.09 and 0.95± 0.04 in the OxATP group and 0.97±0.17,0.96±0.14 and 2.07±0.33 in the BBG group.In both OxATP and BBG group,the expression of P2X7R,NLRP3 and caspase1 in pancreatic tissue were significantly decreased,com⁃pared with the model group(P＜0.05).Pathological results showed that the pancreatic fibrosis was obvious in the model group,while the chronic inflammation and fibrosis indexes of the OxATP and the BBG groups were significantly improved.ConclusionP2X7R antagonists OxATP and BBG significantly decreased pancreatic chronic inflammation and fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis and the mechanism may be associat⁃ed with an inhibition of the P2X7R-NLRP3-Caspase1 signaling pathway.

Chronic pancreatitis;pancreatic fibrosis;purinergic 2X7 receptor;NLRP3 inflammasome

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2017)03-0278-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.03.015

天津市卫生计生委科技基金项目（2014KY39）

1天津市医药科学研究所（天津 300020）

2天津市中西医结合急腹症研究所（天津 300100）

张桂贤，E-mail:zhangguixian2007@aliyun.com