梁现蕊，张会晨，何小嫒，吴 晖，苏为科

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014;2.杭州中美华东制药股份有限公司，浙江 杭州 310011)

阿卡波糖中杂质的分离富集方法研究

梁现蕊1,2，张会晨1，何小嫒1，吴 晖2，苏为科1

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014;2.杭州中美华东制药股份有限公司，浙江 杭州 310011)

采用不同的酸、碱条件对阿卡波糖进行降解反应，可得到其杂质A和D，不同酸碱浓度、温度和降解时间等条件对两种杂质的生成量有较大的影响.结果显示在30 ℃和0.5 moL/L的NaOH溶液中降解3 h杂质A组分产量较高；在25 ℃和12 moL/L的HCl溶液中降解1 h杂质D组分产量较高.降解实验得到的粗品杂质A和D经制备液相色谱进一步分离富集，分别得到高纯度的两种杂质，并采用高分辨质谱对其进行了结构确认.实验对于提高阿卡波糖产品质量标准具有重要意义.

阿卡波糖；杂质A；杂质D；分离富集

阿卡波糖(acarbose)是α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药，是治疗II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)的首选药[1].II型糖尿病患者自身可以分泌胰岛素，但胰岛素分泌量不足或者外周组织胰岛素敏感性降低，使患者血糖变化较大，II型糖尿病占患者的90%，因此II型糖尿病的治疗药物是降糖药研究的重点[2].阿卡波糖跟寡糖的结构类似，能竞争性地与α-葡萄糖苷酶结合，减少寡糖的消化吸收，从而达到降低餐后血糖水平的目的[3].

阿卡波糖的工业生产采用微生物发酵法合成，是由游动放线菌合成的假四糖类次级代谢物，阿卡波糖产品主要从其发酵液中分离制得.然而，发酵过程中除了生成阿卡波糖外，还产生了一些阿卡波糖结构类似物，这些类似物成为阿卡波糖中杂质的主要来源[4-5].药物中的杂质是影响药物纯度的主要因素，杂质的存在直接影响到药物的安全性、有效性和稳定性，将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，将直接关系到上市药品的质量及安全性[6].因此，对阿卡波糖中的杂质进行研究，将对提升阿卡波糖产品质量标准具有重要意义.在杂质的分离分析方法中，高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术集液相色谱的高分离能力与质谱的强结构解析能力于一体，已成为药物杂质分析的有力工具[7-9].目前，已有一些利用离子交换树脂分离富集阿卡波糖的报道[10-11]，但是鲜有关于杂质A和杂质D分离富集方法的报道，为了获得高纯度的杂质A和D，本实验开发了杂质的富集方法，结合制备液相色谱进一步对杂质产物进行了分离制备[12-14]，获得了高纯度的单一杂质产品，为后续阿卡波糖杂质的药理、毒理学研究提供材料，也为准确控制杂质含量提供了依据.

1 实验部分

1.1 材料与试剂

阿卡波糖由杭州中美华东制药股份有限公司提供.乙腈(HPLC级，Merck)，实验用其他试剂均为分析纯，购自天津市永大化学试剂有限公司；实验室用超纯水(18.2 MΩ)由Barnstead TII超纯水系统制得.

1.2 仪器及设备

Waters Delta 600半制备液相色谱仪(Waters，美国)；Agilent 1100液相色谱-Finnigan Advantage LCQ质谱联用仪(Thermo Scientific，美国)；Bruker micrOTOF-Q II串联四极杆-飞行时间质谱仪(Bruker，美国)；Barnstead TII超纯水系统(Thermo Scientific，美国).

1.3 实验方法

1.3.1 阿卡波糖液相色谱检测条件

取阿卡波糖样品用纯水溶解，配置成质量浓度为2 mg/mL的溶液，参照欧洲药典，以磷酸缓冲盐和乙腈作为流动相，进行液相色谱检测[15]；色谱柱为Welch Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长210 nm，流动相组成为V(0.6 g/L的磷酸二氢钾与0.35 g/L的磷酸氢二钠水溶液)∶V(乙腈)=30∶70，进样量5 μL，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min.

1.3.2 液质联用分析条件

高效液相色谱部分为Aglient 1100，液相条件同1.3.1，但将其流动相中的磷酸盐缓冲溶液换成纯水，以免不挥发盐堵塞质谱的毛细管.喷雾电压4 kV，毛细管温度300 ℃，毛细管电压24 V，扫描范围m/z为50～1 000，正负离子模式下检测.

1.3.3 串联四级杆飞行时间质谱分析条件

高分辨质谱(HRMS)数据由OTOF-MS检测得到，质量数精确到小数点后四位并能模拟出分子式.电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下扫描，毛细管电压4 500 V，氮气(N2)作为干燥气和雾化气，干燥气温度180 ℃，雾化器压力40 kPa，干燥气流速4.0 L/min，用浓度为0.01 mol/L的三氟乙酸钠溶液校正质量范围.

1.3.4 阿卡波糖的酸降解液制备

将阿卡波糖样品加入到12 mol/L的盐酸溶液中，配成质量浓度为40 mg/mL的溶液，于恒温培养箱中控制温度为25 ℃，静置1 h，用氢氧化钠溶液中和至中性.

1.3.5 阿卡波糖的碱降解液制备

将阿卡波糖样品加入到0.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，配成质量浓度为40 mg/mL的溶液，于恒温培养箱中控制温度为30 ℃，静置3 h，用盐酸溶液调节pH值至中性.

1.3.6 制备液相色谱制备杂质A和D

通过酸碱降解实验得到高杂产物，使用制备液相分离富集杂质.所用制备型色谱柱为Welch Ultimate XB-NH2(210 mm×250 mm，5 μm)，流速为21 mL/min，检测波长为210 nm,柱温为室温，进样质量浓度40 mg/mL，进样量500 μL，流动相为V(水)∶V(乙腈)=30∶70.

2 结果分析与讨论

实验首先采用HPLC-MS技术对阿卡波糖降解液中的成分进行了检测，以便下一步对阿卡波糖及其杂质进行定位分析.

2.1 HPLC-MS用于阿卡波糖降解液成分分析

2.1.1 酸降解结果的分析

将酸降解液进行液质联用分析，HPLC色谱图和基峰离子流图如图1，2所示.结果显示：在保留时间27 min处出现646.2的离子峰，保留时间、离子峰结果均与阿卡波糖一致，因此判断为阿卡波糖.在保留时间16.3 min处出现484.2的离子峰，根据相关文献报道[2]，杂质D相对阿卡波糖的保留值是0.6，初步判断保留时间16.3 min处是杂质D的[M+H]+峰.

对保留时间16.3 min处484.2的离子峰进行质谱二级裂解，通过调节质谱的锥孔电压，得到了m/z=304.1碎片离子峰，说明该物质失去一个质量分数为180的碎片后生成m/z=304.1的离子，即杂质D脱去一个环的过程.对m/z=304.1的离子进行三级裂解，得到m/z=146.0的碎片，推测其裂解过程为

图1 酸降液的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatography after acid degradation

图2 液质的基峰离子流图Fig.2 Base peak ion chromatogram after acid degradation

2.1.2 碱降解结果的分析

将碱降解液进行液质联用分析，HPLC色谱图和基峰离子流图见图3，4，结果显示：保留时间在25.2 min和27.0 min处均出现646.2的离子峰.根据相关文献报道[2]，阿卡波糖和杂质A的分子量相同，而杂质A相对阿卡波糖的保留值是0.9.因此，根据分子量及相对保留时间推测25.2 min处是杂质A的[M+H]+峰，27.0 min是阿卡波糖的[M+H]+峰.

图3 碱降液的液相色谱图Fig.3 HPLC chromatography after alkali degradation

图4 碱降液的基峰离子流图Fig.4 Base peak ion chromatogram after alkali degradation

对646.2的离子峰进行质谱二级裂解，保留时间在25.2 min和27.0 min的峰裂解后，均得到了m/z=304.1的碎片离子峰.对m/z=304.1的峰进行三级裂解，得到m/z=146.0的碎片离子峰，根据阿卡波糖和杂质A的结构可知：它们均有四个糖环，具有相类似的裂解途径即阿卡波糖和杂质A脱环的过程，推测杂质A裂解过程为

在上述确定杂质A和D的相对保留时间的基础上，进一步考察富集杂质的相关条件.

2.2 不同降解条件对杂质D生成量的影响

2.2.1 酸浓度对降解实验的影响

实验分别取浓度为12，10，8 mol/L的盐酸溶液，对阿卡波糖进行降解实验，恒温培养箱控制温度为25 ℃，1 h后用氢氧化钠溶液中和至中性，HPLC检测杂质峰的变化.结果显示，随着盐酸浓度的降低，杂质D的质量分数也在降低，阿卡波糖不能彻底降解，所以12 mol/L盐酸为较佳酸降解浓度.

2.2.2 温度对酸降解实验的影响

实验取阿卡波糖样品5组，加入12 mol/L的盐酸溶液，配置成质量浓度为40 mg/mL的溶液，在恒温培养箱中分别以15，20，25，30，35 ℃的温度静置1 h，HPLC检测结果显示，25 ℃时杂质D质量分数最高，温度过低导致阿卡波糖不能很好的降解，温度过高会使阿卡波糖过度分解生成其他杂质，故酸降解反应的较佳温度为25 ℃.

2.2.3 反应时间对酸降解实验的影响

进一步考察酸降解时间对杂质D质量分数的影响，采用12 mol/L盐酸溶液为降解液，在25 ℃恒温培养箱中静置反应8 h；定时取样，氢氧化钠溶液中和后进行液相色谱分析，结果如表1所示.

表1 阿卡波糖酸降解实验结果表1)

注：1) 峰面积由面积归一化法计算得到.

实验结果表明：在相同酸浓度和反应温度下，随着反应时间的增加，杂质D质量分数是在不断降低的，阿卡波糖的量也在降低，强酸性条件使杂质D和阿卡波糖都发生了降解，所以得到杂质D粗品的较佳降解条件降解温度为25 ℃、降解时间为1 h、降解液为12 mol/L的盐酸溶液，杂质D的质量分数能达到37.3%.

2.3 不同降解条件对杂质A生成量的影响

2.3.1 碱浓度对降解实验的影响

实验分别取0.5，1.0，1.5 mol/L的氢氧化钠溶液，对阿卡波糖进行降解实验，2 h后用盐酸溶液中和至中性，HPLC检测杂质峰的变化.结果显示，随着氢氧化钠浓度的升高，杂质A的质量分数在降低，碱浓度为0.5 mol/L更有利于阿卡波糖降解转化得到杂质A，所以0.5 mol/L氢氧化钠为较佳碱降解浓度.

2.3.2 温度对碱降解实验的影响

实验取阿卡波糖样品5组，加入0.5 mol/L的氢氧化钠溶液，在恒温培养箱中分别以15，20，25，30，35 ℃的温度静置2 h.HPLC检测结果显示，30 ℃时杂质A质量分数最高，温度过低导致阿卡波糖不能很好的降解，温度过高会使阿卡波糖过度分解生成其他杂质，故降解反应的较佳温度为30 ℃.

2.3.3 反应时间对碱降解实验的影响

进一步考察碱降解时间对杂质A生成量的影响，采用0.5 mol/L氢氧化钠溶液为降解液，在30 ℃恒温培养箱中静置反应8 h；定时取样，用盐酸溶液中和至中性，进行液相色谱分析，结果如表2所示.

表2 阿卡波糖碱降解实验结果表1)

注：1) 峰面积由面积归一化法计算得到.

如表2所示，其他条件不改变，反应时间3 h得到杂质A的质量分数最高，达到了34.9%.综合以上实验结果，优化后的阿卡波糖碱降解得到杂质A的实验条件为降解温度30 ℃，降解时间3 h，降解溶液0.5 mol/L的氢氧化钠.

2.4 杂质的分离纯化与结构表征

用制备液相对酸降解后质量分数为37.3%的杂质D降解液进行分离纯化，结果得到质量分数为98.7%杂质D；对碱降解后质量分数为34.9%的杂质A降解液进行分离纯化，得到质量分数为98.9%杂质A；杂质D和A经高分辨质谱进一步表征，结果如下：

1) 杂质D为白色粉末，在其HRESI-MS正离子质谱图中，在m/z=484.203 7处具有较强的离子峰，为样品的[M+H]+，该离子的准确分子式为C19H34NO13，说明样品的准确分子式为C19H33NO13，与杂质D的分子量和分子式一致.

2) 杂质A为白色粉末，在其HRESI-MS正离子质谱图中，在m/z=646.256 5处具有较强的离子峰，为样品的[M+H]+，该离子的准确分子式为C25H44NO18，说明样品的准确分子式为C25H43NO18，与杂质A的分子量和分子式一致.杂质D和A的结构式分别为

上述高分辨质谱结果并结合液质联用质谱裂解碎片分析结果证明，分离得到的两个化合物分别是杂质D和杂质A，与欧洲药典报道的杂质D和杂质A结构一致.

3 结 论

采用HPLC-MS方法，能有效地鉴别出杂质的保留时间及分子量，可对杂质进行定性分析.实验通过对不同酸碱浓度、温度和降解时间进行筛选，研究了降解富集杂质A和D的较佳条件，并利用半制备液相色谱技术进一步分离纯化得到两个杂质，该分离富集方法可获得较高纯度的杂质单体，且经结构鉴定证实其为预期的杂质.实验所获得的杂质A和D可作为标准物质用于后续的杂质其他方面研究.另外，本研究可为药物杂质分析方法提供一条可借鉴的研究思路，同时为提升阿卡波糖质量标准提供了有力的帮助.

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(责任编辑：刘 岩)

Isolation and preparation methods of acarbose impurities

LIANG Xianrui1,2, ZHANG Huichen1, HE Xiaoai1, WU Hui2, SU Weike1

(1.College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2.Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310011, China)

The degradation of acarbose in acid and alkaline solutions can produce impurity A and D. Concentrations of acid and alkali, temperature and reaction time have great influences on the production of two impurities. The results showed that the degradation time of 3 h at 30 ℃ in 0.5 NaOH moL/L solution could produce higher production of the impurity A. Higher production of the impurity D was obtained with the degradation time of 1 h at 25 ℃ in 12 moL/L HCl solution. The impurities A and D were further isolated and purified by preparative high-performance liquid chromatography, and their structures were confirmed by high resolution mass spectra. The experiment has an important significance for improving the acarbose’s quality standard.

acarbose; impurity A; impurity D; isolation and preparation

2016-11-04

浙江省博士后择优资助科研项目(BSH1502011)

梁现蕊(1975—)，女，山东临沂人，副教授，博士，研究方向为药物结构鉴定与杂质的分离分析，E-mail：liangxrvicky@zjut.edu.cn.

R917

A

1006-4303(2017)03-0289-05