陈中坚+马小涵+董林林+张连娟+尉广飞+肖丽娜+王勇+魏福刚+刘伟林+余育启+陈士林

[摘要] 药用植物DNA标记辅助育种加快新品种选育及推广的进程，保障中药材产业健康发展。该研究以首个三七DNA标记辅助选育新品种—“苗乡抗七1号”为研究对象，系统评价其种子、种苗、块根对根腐病致病菌Fusarum oxysporum的抗性。结果表明，与常规栽培种相比，接种7 d，抗病品种种子病情指数下降52.0%；接种25 d，抗病品种种苗死苗率及块根病情指数分别下降72.1%，62.4%；此外，接種后抗病品种种子及种苗生长抑制率下降。“苗乡抗七1号”种子、种苗、块根对根腐病表现显著的抗性，该品种的抗性评价将为新品种的推广提供依据，保障三七无公害栽培的顺利开展。

[关键词] 三七；根腐病；抗病品种；发病率；病情指数

[Abstract] DNA marked-assisted selection of medicinal plants accelerated the breeding and promotion of new cultivars，and guaranteed the healthy development of Chinese medicinal materials industry. The first disease-resistant cultivar of notoginseng，namely "Miaoxiang Kangqi 1"，served as the object of study. We evaluated the Kangqi′s resistance of seeds，seedlings and root against the pathological bacteria （Fusarum oxysporum） of root rot. Compared to the traditional cultivars，the disease index of notoginseng seeds declined by 52.0% after inoculation for seven days；the death rate of seedlings and disease index of root respectively decreased by 72.1% and 62.4% after inoculation for 25 days. Additionally，the growth inhibition ratio of notoginseng seeds and seedlings declined after inoculation. The seeds，seedlings and roots of “Miaoxiang Kangqi 1” showed significantly resistant to root rot. The evaluation of disease-resistance of Kangqi provided the basis for the popularization of new cultivar and guaranteed the favoring conduct of notoginseng pollution-free cultivation.

[Key words] Panax notoginseng；root rot；disease-resistant cultivars；incidence rate；disease index

DNA 标记辅助药用植物新品种的选育，该方法不仅准确性高而且缩短育种周期。研究团队利用DNA标记辅助育种结合系统选育的方法，培育了首个三七抗病新品种—苗乡抗七1号（云林园植新登第2016060号）；该研究基于简化基因组测序技术检测出抗病群体的特异SNP位点，利用与三七抗根腐病相关的SNP位点筛选抗病群体进而辅助系统选育，该方法提高选育效率并缩短了选育周期[1]。此外，研究团队通过全基因组测序筛选出30个非同变异突变SNP标记作为中研肥苏1号（京品鉴药2016054）特异性SNP标记用于紫苏新品种的材料鉴选[2]。DNA标记辅助育种技术应用于重要农艺性状的定位，有效筛选出高产、优质、抗逆的药用植物新品种。

根腐病是三七的主要病害类型，该病害造成损失可达70%以上，甚至导致毁园绝收[3]。研究表明，随着三七种植年限的增加，根腐病致病菌Fusarum oxysporum丰度显著增加，三七死苗率逐年升高[4]。根腐病害的有效防治是保障三七产业可持续发展的前提。当前化学防治是三七根腐病的主要防治方法，种植生产中使用的农药（杀菌剂）成份近70种以上[5]。种植环节频繁使用农药导致药材农药及重金属等有害物质污染严重，而性状优良、抗逆性强三七新品种的大面积推广将减少农药的使用量，降低农残对环境及人体健康的危害，促进并保障三七无公害栽培的推广。本文通过对“苗乡抗七1号”的种子、种苗、块根进行系统的抗性评价，进而保障三七抗病品种大面积推广的顺利开展。

1 材料与方法

1.1 三七种子催芽处理 将“苗乡抗七1号”及三七普通栽培种的种子进行沙培催芽处理用于后续试验。选取饱满的三七种子进行脱皮处理，脱皮后的种子采用10% H₂O₂消毒10 min，与灭菌处理的细沙混匀（2∶1，含水量80%），放置22 ℃恒温培养箱，每天补充灭菌水以保证其含水量。

1.2 三七种子的抗性评价 挑选露白后大小一致的三七种子进行发芽试验。将灭菌后的双层滤纸放置在9 cm玻璃培养皿中，10% H₂O₂消毒5 min后的种子经灭菌水清洗3～5次并放置在滤纸上，加入4 mL灭菌水后放至25 ℃恒温培养箱中进行发芽试验。每皿中放置10粒三七种子，5次重复。7 d后，用灭菌针将三七胚根部位划伤，进行接种试验。接种菌株为根腐病的致病菌尖孢镰刀菌Fusarum oxysporum，该菌株分离于三七根腐病块根中并具有较高的致病性[4]。处理组为：普通栽培种及抗病品种种子分别接种1 mL F. oxysporum菌液 （1×10⁶cfu·mL^-1）至培养皿中；对照组为：普通栽培种及抗病品种种子分别接种1 mL灭菌后的菌液。接种后，每24 h记录发病情况并统计发病率及发病指数；7 d之后，统计三七种子的根长，评价普通栽培种及抗病品种种子对根腐病的抗病性。

1.3 三七种苗的抗性评价 将催芽后的三七种子播种于灭菌后的营养土中，接种病原菌评价三七种苗的抗病性。选取大小一致的种子播种育种穴盘，待种苗生长30 d之后，进行接种试验。处理组为：普通三七及抗病品种的种苗根际接种500 μL 的F. oxysporum菌液（1×10⁶cfu·mL^-1）；对照组为：普通三七及抗病品种种苗根际接种灭菌后菌液（500 μL），接种后每5 d统计三七死苗率，25 d之后，记录三七种苗的株高，叶面积及鲜重，分析普通栽培种及抗病品种的生长指标。其中，叶面积=中叶长×中叶宽，每种处理50株，3次重复。

1.4 三七块根的抗性评价 通过盆栽接种试验，评价三七块根的抗病性。参照王瑞等[6]方法稍作调整，将健壮的两年生普通三七栽培种及抗病品种块根切伤，处理组三七块根浸泡于F. oxysporum孢子悬浮液（1×10⁶cfu·mL^-1），对照组块根浸泡于灭活的菌液，过夜处理后将三七块根栽种于灭菌后的营养土中，每5 d随机取10株记录块根的发病率及病情指数。每组处理50株，3次重复。

1.5 病害分析 三七根腐病发病率=（染病株数/调查总株数）×100%。三七死苗率=（死苗株数/调查总株数）×100%。三七病情指数=[（各级病株数×相应级数）/调查总株树×最高级别值] ×100%，三七病情根据Vakalounakis 等[7]报道进行分级，分为0级，1级，2级，3级，0级=根部无发病症状；1级=根部轻微或中度变褐；3级=根部严重变褐；4级=根部腐烂或死苗。

1.6 数据分析 采用SPSS 16.0软件，在0.05水平进行显著性方差分析。

2 结果

2.1 三七种子抗性评价 苗乡抗七1号的种子对根腐病致病菌F. oxysporum表现显著抗性（图1）。伤根接种致病菌F. oxysporum 1 d，普通栽培种发病率为85.0%，接种2 d发病率达100%；而接种1 d抗病品种发病率为55.0%，接种2 d发病率达85%，接种4 d发病率达100%，接种灭活菌液的三七种子未出现根腐病的病害症状（图1a）。结果表明，与普通栽培种相比，抗病品种延缓根腐病发病时间。随着接种时间的延长，三七种子根腐病的病情指数增加，接种1～7 d，普通栽培种根腐病的病情指数为31.7%～83.3%，抗病品种根腐病的病情指数为18.3%～40.0%，与普通栽培种相比，抗病品种病情指数下降42.3%～52.0%（图1b）。

根腐病致病菌导致三七根尖变褐，须根及主根生长受到抑制（图2a），接种失活菌液的普通栽培种及抗病品种根长分别为2.50，2.30 cm，接种活性致病菌的普通栽培种及抗病品种根长分别为1.51 cm，1.72 cm（图 2b）；与对照组相比，普通栽培种及抗病品种相比，其根长分别下降39.8%，25.4%。结果表明，与普通栽培种相比，接种后抗病品种种子生长抑制率下降。

2.2 三七种苗抗性评价 苗乡抗七1号种苗对根腐病致病菌F. oxysporum表现显著抗性（图3）。接种致病菌的三七种苗根部变褐，严重者根部腐烂，地上部倒伏枯萎，接种灭活菌液的三七种苗均为出现根腐病症状（图3a）。接种10 d以内，普通栽培种死苗率为5.0%～15.2%，而抗病品种未出现死苗现象；接种10～25 d以内，普通栽培种死苗率35.0%～65.0%，而抗病品种死苗率为10.0%～26.7%；与普通栽培种相比，抗病品种死苗率下降58.9%～72.1%（图3b）。未接菌的普通栽培种及抗病品种均未出现根腐病症状。

接种25 d之后，与普通栽培种相比，抗病品种种苗生长抑制率下降（图4）。未接种活性菌的普通栽培种（对照组）株高、叶面积、鲜重分别为6.39 cm，3.62 cm2，0.46 g/株；接种活性菌的普通栽培种（处理组）株高、叶面积和鲜重分别为5.98 cm，3.01 cm-2，0.36 g/株。未接种活性菌的抗病品种（对照组）株高、叶面积和鲜重分别为5.77 cm，2.86 cm2，0.40 g/株；接种活性菌的抗病品种（处理组）株高、叶面积和鲜重分别为5.52 cm，2.52 cm2，0.35 g/株。与对照组相比，普通栽培种株高、叶面积和鲜重分别下降6.4%，16.9%，21.7%；抗病品种株高、叶面积和鲜重分别下降4.3%，11.9%，12.5%。

2.3 三七块根抗病性评价 “苗乡抗七1号”的两年生幼苗对根腐病致病菌F. oxysporum表现显著抗性（图5）。根腐病致病菌导致三七须根脱落，根部变褐色甚至腐烂，接种灭活菌的三七块根未出现根腐病症状（图5a，b）。接种活性菌15天以内，抗病品种根腐病的发病率为12.0%～62.7%，而普通栽培种根腐病发病率为26.0%～100%，与普通栽培种相比，抗病品种根腐病发病率显著下降37.3%～53.8%（图5c）。随着接种活性菌时间的增加，三七块根的病情指数增加，抗病品种根腐病病情指数为6.3%～38.3%，普通栽培种的病情指数为16.8%～65.0%，与普通栽培种相比，抗病品种根腐病的病情指数显著下降35.8%～62.4%（图5d）。

3 讨论

本研究对首个DNA标记辅助培育的三七新品种——“苗乡抗七1号”的抗病性进行系统性评价，该品种种子、种苗及块根对根腐病致病菌F. oxysporum表現显著抗性。与普通栽培种相比，接种活性菌7 d抗病品种种子病情指数下降52.0%；接种25 d，抗病品种种苗死苗率下降72.1%，抗病品种块根病情指数下降62.4%。三七无公害栽培的目的为栽培出健康无害的三七植物，同时满足自然环境正常有序发展要求的栽培模式，进而达到无公害品质。前期工作中，规定25项农药种类、4项重金属的限量指标作为无公害品质三七药材及饮片的判定依据[5]。因此，“苗乡抗七1号”对根腐病表现显著的抗性，将为三七无公害栽培的推广提供基础。

与普通栽培种相比，接种试验中“苗乡抗七1号”种子及种苗生长抑制率下降，种子及块根发病时间延缓。三七单株根重、株高等农艺性状与种苗质量相关，而三七产量与种苗等级呈正相关[8]。“苗乡抗七1号”种子种苗的抗病性是实现三七产量的保障。根腐病是药用植物生产中的一种毁灭性病害，该病发生后，容易传染、发病率高、防治困难，具有“植物癌症”之称，一般药用植物根腐病的发病率为10%～30%，严重时可达70%～80%，有时甚至100%，导致中药材绝产绝收[9]。三七根腐病的病原菌具有多样性，但以真菌为主，F.solani，F. oxysporum，F. monilliforme均能造成三七根腐病的发生[10-12]。研究团队前期工作中，分离到三七根腐病的高毒致病菌F. oxysporum[4]。本文以F. oxysporum作为抗病品种病原菌进行检验，其结果具有代表性。

三七抗病新品种的推广将促进中药产业的可持续发展。三七是血塞通、云南白药、片仔癀等药品的主要原料，每年三七的社会需求量为 1.5万t左右，截止至 2015 年，云南省三七药材及其饮片制品的市场规模已经达到每年 150亿元人民币的产值[5]。为满足日益增长的需求，三七人工栽培已形成较为成熟的技术体系，然而三七为典型的生态脆弱性植物，其分布区域较窄，存在连作障碍严重等问题[13-15]。三七栽培过程中，频繁使用农药，导致药材中农药和重金属污染现象严重，中药材质量每况愈下，危害人类健康及环境安全。为保证三七药材质量，保护人类健康及生态环境安全，陈士林等[16]提出发展無公害中药材生产，建立标准化、规范化技术体系，已成为中药材生产发展和促进中药产业健康发展的必然方向和迫切需要；并指出从生产基地选址、基地环境、野生抚育等栽培管理技术、采收、产地加工技术、病虫害综合防治及质量控制技术等方面实施标准化、规范化，确保生产无污染、高品质、安全的中药材，保证消费者生命安全和身体健康。此外，研究团队也指出土壤改良、新品种选育、安全和低毒的病虫害防治是三七无公害栽培的主要环节[17]。苗乡抗七1号的推广将有效的克服三七物种存在的主要障碍并将促进绿色中药农业的科学化和规模化发展。

[参考文献]

[1] 董林林，陈中坚，王勇，等. 药用植物DNA标记辅助育种（一）三七抗病品种选育研究[J]. 中国中药杂志，2017，42（1）： 56.

[2] 沈奇，张栋，孙伟，等. 药用植物DNA标记辅助育种II丰产紫苏新品种SNP辅助鉴定及育种研究[J].中国中药杂志，2017，42（9）：1668.

[3] 陈中坚，杨莉，王勇，等. 三七栽培研究进展[J]. 文山学院学报，2012，25（6）： 1.

[4] Dong L，Xu J，Feng G，et al. Soil bacterial and fungal community dynamics in relation to Panax notoginseng death rate in a continuous cropping system [J]. Sci Rep，2016，6：31802.

[5] 王勇，余育启，陈士林，等.三七药材及饮片农药残留与重金属含量限量标准研究[J].世界科学技术——中医药现代化，2016，18（11）： 1955.

[6] 王瑞，董林林，徐江，等. 农田栽参模式中人参根腐病病原菌鉴定与防治[J]. 中国中药杂志，2016，41（5）： 1787.

[7] Vakalounaksis D J，Wang Z，Fragkiadakis G A，et al. Characterization of Fusarium oxysporum isolates obtained from cucumber in China by pathogenicity，VCG，and RAPD [J]. Plant Dis，2004，88： 645.

[8] 崔秀明，王朝梁，陈中坚. 种苗分级对三七生长和产量的影响[J]. 中药材，1998（2）： 60.

[9] 穆向荣，马逾英，杨枝中，等. 药用植物根腐病防治的研究进展[J]. 中药与临床，2014，5（2）： 5.

[10] 曹福祥，戚佩坤. 田七根腐病的病原菌鉴定[J]. 植物病理学报，1991，21（2）：89.

[11] 王拱辰，陈鸿逵，骆平西. 三七根腐病病原菌分离、接种和药剂试验[J]. 植物病理学报，1991，21（2）： 144.

[12] 罗文富，喻盛甫，黄琼，等. 三七根腐病复合侵染中病原菌的研究[J]. 云南农业大学学报，1999，14（2）： 123.

[13] 陈中坚，孙玉琴，黄天卫，等. 三七栽培及其GAP研究进展[J]. 世界科学技术——中医药现代化，2005，7（1）： 67.

[14] 孟祥宵，黄林芳，董林林，等. 三七全球生产布局及品质生态学研究[J]. 药学学报，2016，51（9）：1483.

[15] Dong L，Yao H，Li Q，et al. Investigation and integrated molecular diagnosis of root-knot nematodes in Panax notoginseng root in the field [J]. Eur J Plant Pathol，2013，137（1）：667.

[16] 陈士林，黄林芳，陈君，等. 无公害中药材生产关键技术研究[J].世界科学技术——中医药现代化，2011，13（3）： 436.

[17] 董林林，谷利婷，徐江，等. 三七无公害栽培体系的探讨[J].世界科学技术——中医药现代化，2016，18（11）： 1975.

[责任编辑 吕冬梅]