孙向明，宋 辉，丁晶鑫，徐昶儒，李文兰

(1. 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)



吴茱萸醇提物多次给药致大鼠肝毒性研究

孙向明1，宋 辉1，丁晶鑫1，徐昶儒1，李文兰2

(1. 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

为了研究吴茱萸醇提物多次给药对大鼠肝脏的毒性损害，取大鼠按不同剂量分别灌胃给予吴茱萸的50%乙醇提取物，每天1次，连续14 d.于末次给药后60 min采血，检测血清中ALT、AST的水平，计算肝脏指数，光学显微镜下观察肝组织的病理学改变.结果表明,与对照组比较，给药组大鼠肝脏系数和血清中ALT、AST的水平均明显升高，高剂量组具有极显著差异.病理学检测发现不同程度的肝细胞脂肪变性，炎性细胞浸润和小灶坏死.多次给大鼠灌胃吴茱萸醇提物可对其产生一定的肝毒性，毒性随给药剂量的增加而增大.

吴茱萸；醇提物；肝毒性

吴茱萸是一味临床常用的传统中药，为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth var. officinalis (Dode) Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth. Var. bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实.具有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻的功效[1].国内外的研究表明吴茱萸的主要化学成分包括生物碱、苦味素、挥发油等[2-5]，有镇痛、抗炎、抗菌、抗癌和细胞毒等活性[6-10].历代文献均记载吴茱萸“有毒”或“小毒”，2006年曾有因大剂量服用吴茱萸出现胸闷、头痛、视物不清、剧烈腹痛等症状的个案报道[11].近年来有关吴茱萸的肝毒性日益受到关注，多以水煎液和挥发油作为研究对象[12-13]，然而临床常用的吴茱萸制剂也包括醇提工艺制备的“吴茱萸降压颗粒”等[14].本课题组前期实验发现吴茱萸对小鼠肝脏具有一定的毒性，并筛选出其毒性部位为50%乙醇提取物.考虑到种属差异对实验结果的影响，为进一步完善吴茱萸的肝毒性研究，明确其作用特点，本实验以大鼠为研究对象，考察多次灌胃给予吴茱萸乙醇提取物对肝脏靶器官的毒性作用，为吴茱萸的临床用药安全和剂量设计提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，雌雄各半，体重120～150 g，购自长春国家生物产业基地实验动物中心，合格证号：SCXK-(吉)2003-0004.

1.2 药品及试剂

吴茱萸药材购自哈尔滨三棵树中药材专业市场，经哈尔滨商业大学药学院张德连教授鉴定，系芸香科植物吴茱萸.将干燥的吴茱萸药材粉碎得到粗粉，称取适量，50%的乙醇浸泡过夜.50%乙醇加热回流提取两次，提取溶剂体积分别为药材粗粉量的8倍和7倍，提取时间分别为2 h和1.5 h.提取液经过滤、合并后减压浓缩至无醇味，55 ℃蒸干得浸膏，用蒸馏水分别制成相当于生药质量浓度为0.7、1.4 g/mL的混悬液，作为灌胃药液备用.

天门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 测试盒 (微板法)，批号20140905；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试盒 (微板法)，批号20140905.以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.甲醛为分析纯(上海科锐试剂有限公司).

1.3 仪 器

旋转蒸发仪(V1001，上海夏丰实业有限公司)；低速台式自动平衡离心机(DT5-2，北京时代北利离心机有限公司)；电子分析天平(AR1140，美国奥豪斯国际有限公司)；酶联免疫检测仪(Bio-rad680，美国伯乐公司)；病理切片机(RM2235，德国莱卡公司)；显微镜(55i，日本尼康公司).

1.4 方 法

取大鼠30只，雌雄各半，随机分成3组，分别为对照组，低剂量组和高剂量组，对应的灌胃剂量(按生药计)分别为等量的蒸馏水，12.5 g·kg-1·d-1和25 g·kg-1·d-1，每天1次，连续灌胃14 d.末次给药60 min后，大鼠称重，眼眶静脉丛采血1 mL，放置30 min，充分凝血后，以3 000 r/min转速离心15 min，取上层血清，按检测盒说明书方法，采用酶标仪检测血清中ALT、AST的水平.处死大鼠，剥离肝脏称重，计算肝脏指数(肝脏指数=肝重/体重×100).取肝组织固定于10%的甲醛溶液中，石蜡包埋切片，经HE染色，置光学显微镜下观察.

1.5 统计方法

各组数据均以x±S表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，考察给药组与对照组之间是否具有显著性差异.

2 结 果

2.1 对大鼠一般情况及体重、肝脏系数的影响

在整个14 d的灌胃给药期间，给药组大鼠的进食、活动情况均正常，毛色较对照组也无异常变化，各组均无动物死亡.与空白组比较，给药组大鼠的体重并无明显差异.高剂量组的肝重和肝脏系数与对照组比较均明显升高(P<0.01)，具有极显著性差异；低剂量组的肝重和肝脏系数与空白组比较有增大的趋势，但没有统计学差异，见表1.

表1 吴茱萸醇提物对大鼠体重、肝重及肝脏系数的影响±S，n=10)

注：与对照组相比较1)P<0.01

2.2 对大鼠血清中ALT、AST的影响

给大鼠连续灌胃吴茱萸乙醇提取物14 d后，大鼠血清中的ALT、AST水平明显升高，且高剂量组升高的程度明显高于低剂量组.与对照组比较，低剂量组的ALT、AST均有显著性差异(P<0.05)，高剂量组具有极显著性差异(P<0.01).见表2.

表2 吴茱萸醇提物对大鼠血清ALT、AST的影响(x±S，n=10)

注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 对大鼠肝脏病理学的影响

对照组：肉眼可见肝脏大小形态正常，红润有光泽.光镜下肝小叶结构清晰，中央静脉无明显异常，肝窦清楚，未见炎性细胞浸润，肝细胞有轻微的胞浆疏松，核结构清晰.

低剂量组：肉眼可见肝脏大小正常，呈暗红色，未见明显坏死区域.光镜下部分肝细胞内出现明显的小脂滴空泡，提示肝细胞脂肪变性，有少量的炎性细胞浸润.

高剂量组：肉眼可见肝脏肿大，肝表面有斑点状充血.光镜下可见明显的肝细胞脂肪变性，存在点状小坏死灶及大量炎性细胞浸润，部分大鼠肝细胞表现为严重空泡样变性伴红细胞渗出.各组情况分别见图1～3.

图1 对照组大鼠肝脏病理切片(×400)

图2 低剂量组大鼠肝脏病理切片(×400)

图3 高剂量组大鼠肝脏病理切片(×400)

3 讨 论

肝脏作为人体药物代谢的主要器官，特别容易受到药物造成的损害, 成为药源性组织损伤的主要靶器官之一.随着中药在世界范围内的广泛的应用，有关其诱发药源性肝损伤的报道也逐渐增多[15-16]，中药安全性的问题也引起了国内外医药学界的广泛关注.有研究表明，单次或多次给小鼠灌胃吴茱萸水煎液、挥发油均能造成小鼠不同程度的肝损伤.本实验旨在考察灌胃给予吴茱萸50%乙醇提取物14 d后，大鼠肝脏的受损情况，为进一步揭示吴茱萸肝毒性部位的毒性机制提供可靠的参考依据.结果表明，吴茱萸50%乙醇提取物对大鼠的肝功能造成了不同程度的影响，给药后的大鼠血清中ALT、AST水平及肝脏系数均明显升高，且高剂量组与对照组比较差异极显著.ALT是一种主要存在于肝细胞浆中的酶，是反映肝损害的灵敏指标，当肝细胞受到损害后，细胞膜的通透性增加甚至破碎，胞浆内的ALT随之被释放到血液中，使血中的ALT 含量增加，只要有1%的肝细胞受到损害，就可使血中 ALT 水平明显升高，在急性肝损伤时 ALT水平升高更为显著.AST是主要存在于肝细胞浆和线粒体内的酶类，是反映肝细胞坏死的标准，发生急性肝损伤时血中含量也升高，但由于也存在于心脏、红细胞和骨骼肌中，所以并不是肝脏细胞的专属性酶.由本实验的结果可以推测大鼠灌胃吴茱萸后，肝细胞受到了损伤，可能伴随肝细胞坏死.

然而ALT、AST的升高并非肝损伤的唯一指征，也可能表示其他疾病或情况[17-18]，我们进一步做了病理学检测，发现大鼠肝细胞出现了不同程度的弥散及脂肪变性，存在小坏死灶和大量的炎性细胞浸润等病理改变，据此，判断吴茱萸的醇提物可造成大鼠的肝损害.从种种病理学改变分析，我们推测其肝毒性机制也可能是多种因素共同作用的结果.通常，引起脂肪变性的原因是细胞脂肪代谢障碍和结构脂肪被破坏，肝脏作为脂肪代谢的主要器官，最容易发生脂肪变性.炎症因子的产生可引起炎性细胞浸润，导致肝细胞变性、坏死.此外，某些亲脂性药物可使肝药酶的合成显著增加，药酶的诱导有时可造成药物性肝损伤.但有些药物，在肝内经过细胞色素P450药酶作用，会代谢转化为具有肝毒性的代谢产物.因此，后期将从脂肪代谢障碍、炎症因子产生、P450酶的诱导以及代谢产物鉴定等方面入手，深入研究吴茱萸致肝毒性的作用机制.

[1] 国家药典委员会. 中国药典[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015.

[2] TANG Y Q, FENG X Z, HUANG L. Studies on the chemical constituents of Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. [J]. J Chin Pharm Sci, 1997, 6(2): 65-691.

[3] CHUANG W C, CHENG C M, CHANG H C,etal. Contents of constituents in mature and immature fruits of evodia species [J]. Planta Med, 1999, 65(6): 567-571.

[4] SUGIMOTO T, MIYASE T, UENO A. Limonoids and quinolone alkaloids from Evodia rutaecarpa Benth [J]. Chem Pharm Bull, 1988, 36: 4453-4461.

[5] CAI G X,HUANG D,LI S X,etal. Comparative analysis of essential oilcomponents of Evodia rutaecarpa(Juss.) Benth. var. officinalis (Dode) Huang and Evodia rutaecarpa(Juss.) Benth [J]. Nat Prod Res,2012, 26(19): 1796-1798.

[6] MATSUDA H,WU J X,TANAKA T,etal. Antinociceptive activities of 70% methanol extract of evodiae fructus (fruit of Evodia rutaecarpa var. bodinieri) and its alkaloidal components [J]. Biol Pharm Bull, 1997, 20(3): 243-248.

[7] KO H C, WANG Y H, LIOU K T,etal. Anti-inflammatory effects and mechanisms of the ethanol extract of Evodia rutaecarpa and its bioactive components on neutrophils and microglial cells [J]. Eur J Pharmacol, 2007, 555(2-3): 211-217.

[8] TOMINAQA K, HIQUCHI K, HAMASAKI N,etal. In vivo action of novel alkyl methyl quinolone alkaloids against Helicobacter pylori [J]. J Antimicrob Chemother, 2002, 50(4): 547-552.

[9] JIANG J, HU C. Evodiamine: a novel anti-cancer alkaloid from Evodia rutaecarpa [J]. Molecules, 2009, 14(5):1852-1859.

[10] HUANG X, LI W, YANG X W. New cytotoxic quinolone alkaloids from fruits of Evodia rutaecarpa [J]. Fitoterapia, 2012, 83(4):709-714.

[11] 蔡雪映, 孟 楠, 杨 冰. 服用吴茱萸过量致中毒1例分析[J].北京中医药, 2006, 35(3): 171-172.

[12] 周 绮, 张 茜, 金若敏. 吴茱萸致小鼠肝毒性时效、量效关系研究[J].中国实验方剂学杂志, 2011, 17(9): 232-235.

[13] 李晓宇, 吴晓文, 窦立雯, 等. 吴茱萸挥发油多次给药致小鼠肝毒性氧化损伤机制研究 [J].中国药物警戒, 2015, 12(1): 16-19.

[14] 张丽艳, 杨玉琴, 刘 毅, 等. 吴茱萸降压颗粒提取工艺研究[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(7): 828-831.

[15] TESCHKE R,WOLFF A,FRENZEL C,etal. Herbal hepatotoxicity: a tabular compilation of reported cases [J]. Liver Int, 2012. 32(10): 1543-1556.

[16] WANG J,JI L,LIU H,etal. Study of the hepatotoxicity induced by Dioscorea bulbifera L. rhizome in mice [J]. Biosci Trends, 2010, 4(2): 79-85.

[17] KIM W R. Clinical implications of short-term variability in liver function test results [J]. Gastroenterology, 2008, 135(3): 1010-1011.

[18] 陈 晨，孙向明，刘 悦，等.吴茱萸致肝毒性后大鼠体内样品的稳定性研究[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2017，33(1)：4-7.

Study on hepatotoxicity of rats caused by multiple dose ethanol extract from Evodia rutaecarpa

SUN Xiang-ming1, SONG Hui1, DING jing-xin1,XU Chang-ru1,LI Wen-lan2

(1. Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

To study on toxic damage of rats liver induced by multiple dose ethanol extract from Evodia rutaecarpa, the rats were administered with gavage solution at different doses once a day for 14 d. The blood samples were collected at 60 min after the last gavage. The levels of serum ALT, AST and liver index were tested, and the pathology change of liver tissue was observed under optical microscope. The results indicated that compared with control group,liver index and serum ALT, AST of medication group rats were obviously increased, and the high dose group has significant difference. Pathology examination showed different degree of hepatocyte fatty degeneration liver steatosis, inflammatory cells infiltration and stove necrosis. Ethanol extract from Evodia rutaecarpa could cause hepatotoxicity which increased with the increase of dose.

Evodia rutaecarpa; ethanol extract; hepatotoxicity

2016-12-16.

黑龙江省教育厅科研项目(12541192)；哈尔滨市应用技术研究与开发项目(2015RQQXJ091，2015RQXXJ011)

孙向明(1984-)，女，博士，研究方向：中药药效物质基础.

李文兰(1967-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药药效物质基础.

R285

A

1672-0946(2017)03-0257-03