吴一飞，韦露莎，陈 辉

(1.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119)

基于FPLC-LC-MS/MS分析嗜盐古菌Haloarculahispanica胞内类泛素化底物

吴一飞1，韦露莎2，陈 辉1

(1.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119)

本研究结合SLIC克隆技术和快速蛋白质液相色谱-高效液相色谱-串联质谱(FPLC-LC-MS/MS)法，对嗜盐古菌Haloarculahispanica类泛素蛋白ThiS的泛素化底物和缀合位点进行鉴定分析。采用SLIC克隆法构建类泛素蛋白ThiS表达质粒/整合质粒，经转染后的菌株在DMSO呼吸作用诱导下表达并纯化His6-ThiS蛋白缀合体。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，质粒型类泛素ThiS的表达远远高于基因型菌株的表达量，而通过定点突变，将ThiS的第89号位点突变成赖氨酸K和精氨酸R，进而使用胰蛋白酶对ThiS肽段上的赖氨酸残基-双甘氨肽标签进行酶切处理，采用LC-MS/MS法鉴定其底物和底物修饰位点。鉴定得到钼喋呤合成酶MoaE，蛋氨酸亚砜还原酶MsrA和其同系物MsrB，以及Fe-S簇组装蛋白SufB等4种底物蛋白。该方法通过结合蛋白位点突变和质谱检测，能够准确、有效地检测泛素/类泛素蛋白的修饰底物及其修饰位点，为深入泛素的生物性功能研究提供了切入点。

类泛素；LC-MS/MS；SLIC克隆；嗜盐古菌；蛋白缀合

泛素(Ubiquitin, Ub)作为蛋白修饰已得到广泛的研究，其主要职能是识别并锁定目标蛋白底物，并将底物蛋白运送至蛋白酶体处进行回收[1-3]。当细胞体内泛素化底物不能被蛋白酶水解时，则会引起包括膜泡蛋白运输异常、染色质传递动力变化、DNA修复、多亚基化合物中的蛋白提取功效变化等一系列的影响[4-5]。……