曾 明,杜晓云,吴美华,王彦波

(江西省农业科学院 园艺研究所,江西 南昌 330200)

江西柿属种质资源遗传多样性的IRAP标记分析

曾 明,杜晓云*,吴美华,王彦波

(江西省农业科学院 园艺研究所,江西 南昌 330200)

利用逆转座子间扩增多态性(Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism, IRAP)分子标记对收集的49份江西柿属种质资源进行了遗传多样性分析。从26个IRAP引物中筛选出扩增条带清晰且多态性丰富的10个引物,PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)得到清晰的指纹图谱。将418条清晰条带(多态性100%)转换为0/1矩阵,聚类分析结果表明：供试的江西柿属种质资源的遗传相似系数在0.69～0.92之间,分属柿、油柿、野柿三个种,遗传多样性丰富;明晰了几个分类关系模糊的柿种质资源的种属关系。

江西;柿属;种质资源;遗传多样性;IRAP

柿属(Diospyrosspp.)植物包含近500个种[1],广泛分布于温带、亚热带和热带地区,我国有近70个种和变种[2]。柿(DiospyroskakiL.)作为柿属中最具代表性的栽培树种,经济价值大,品种繁多,我国经过鉴定、整理统计的原产柿品种资源有1058个[3]。江西柿属植物资源丰富[4],各传统产区有许多地方栽培种以及实生野生资源[5]；因未系统地对这些资源进行遗传多样性研究,多数资源的分类地位和亲缘关系不清楚,不利于柿属种质资源的鉴定、保护和利用。

分子标记因其多态性丰富、稳定性好,成为植物种质资源鉴定和遗传多样性研究最常用的方法[6-8]。目前,柿属植物中已报道的DNA分子标记涉及五大类13种[9],其中基于反转录转座子的分子标记因具有灵敏度高、基因覆盖度广和多态性丰富等特点,尤其适用于种质资源遗传多样性研究和品种鉴定[10]。由Kalendar开发的逆转座子间扩增多态性(IRAP)标记技术,可以揭示基因组中逆转座子之间序列的多样性[11],相对于其他逆转座子分子标记如RBIP、SSAP、REMAP,其操作步骤简化，灵敏度更高[12]。杜晓云等(2006)成功建立了柿属IRAP标记,并进行了部分柿属植物指纹图谱构建和遗传关系分析[13]。

我们分析了49份江西柿属种质资源的IRAP分子标记,通过比琼脂糖凝胶电泳分辨率更高的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)得到清晰的指纹图谱，通过聚类分析明晰了各种质资源的遗传多样性和亲缘关系,确定了部分分类模糊的资源的种属关系,可为江西柿属种质资源的鉴定、保护和利用提供可靠的依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试柿属种质资源材料见表1,其中49份材料是对江西本地资源调查后通过异位嫁接保存于江西省农业科学院柿资源圃的样本;阳丰(Youhou)、君迁子(D.lotus)、浙江柿(D.glaucifolia)、油柿(D.oleifera)、金枣柿(D.zhejiangensis)、老鸭柿(D.rhombifolia)采自华中农业大学柿种质资源圃。引物由Invitrogen公司(上海)合成,2×Easy Taq PCR Super Mix试剂购自TRANSGEN公司,其它药品主要来自Solarbio公司。

表1 供试的柿属种质资源样本及来源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 基因组总DNA的提取参考Luo Z R, et al.(1995)[14]的方法。使用微量核酸仪检测DNA的质量及浓度,A260/A280比值在1.8左右,将终浓度稀释至20 ng/μL,在4 ℃下保存备用。

1.2.2 PCR扩增和引物筛选 PCR扩增体系参考Du X Y, et al.(2009)[15]，在20 μL反应体系中含模板DNA(20 ng/μL)4 μL、引物(10 μmol/L)3.2 μL、2×Easy Taq PCR Super Mix 10 μL、水2.8 μL。扩增程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min ramp+0.6 ℃/s,72 ℃ 2 min,42个循环;72 ℃延伸8 min,4 ℃终止。

通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测IRAP扩增情况，进行引物筛选,26条引物序列参考Du X Y, et al(2008)[16]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 用筛选出的引物对所有样本进行扩增,扩增产物变性后进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳[16],用数码相机拍照记录电泳图谱。

1.2.4 数据处理 将电泳图谱中清晰的条带按1(有)、0(无)记录,通过NTSYSpc v2.10e软件[17]进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

根据各引物所扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测情况,筛选扩增片段在200～500 bp且条带清晰、多态性良好的引物。最后选出10条引物:PPT1、PPT3、PPT6、PPT7、PPT8、SAF2、SAF5、SAR1、SAR6、SAR10。部分引物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。

序号1～55代表的基因型详见表1；M: 100 bp DNA Ladder。

2.2 IRAP标记的指纹图谱

扩增产物变性后经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)得到指纹图谱,其条带较琼脂糖凝胶电泳更丰富且清晰度更高,部分引物的指纹图谱如图2。

序号1～55代表的基因型详见表1； M: 100 bp Plus ⅡDNA Ladder。

2.3 PAGE条带的统计结果

PAGE图谱显示的条带大多分布在100～600 bp,过小或过大的片段在6%聚丙烯酰胺凝胶中不易识别,最佳范围是200～500 bp,条带清晰易辨。10个引物共扩增出418条PAGE清晰条带,多态比例达100%(见表2)。

表2 10个引物扩增的PAGE条带统计分析结果

2.4 遗传多样性聚类结果

基于418条谱带的UPGMA聚类图见图3。所有供试样本的遗传相似系数在0.58～0.92之间,根据相似系数将它们划分成4个群体:柿种群(Ⅰ)、油柿种群(Ⅱ)、野柿种群(Ⅲ)和其他种群(Ⅳ)。在0.718处,可将柿和柿属其他种(油柿、野柿、老鸦柿、金枣柿、君迁子及浙江柿)区分开;4个油柿样本聚类关系较近,与形态学分类结果相符;野柿3号(YES3)和宜丰5号(YES2)聚类关系相近,且不在柿种之内,表明两者同归属野柿种。在柿种样本中,与其他柿样本相似性最小的是宜丰10号(相似系数0.740),表明它与其他柿样本的亲缘关系较远;其次是日本完全甜柿品种阳丰(0.745),表明完全甜柿和涩柿之间差异明显。野柿4号(YES4)、宜丰4号(YES1)和枣柿(疑似君迁子类型)在聚类图中与柿种聚在一起,与非柿种的样本相距很远,所以在此聚类中应划归为柿种。总的来看,柿种样本有少数显示地域性亲缘相近(如高安的方柿1号与方柿2号相近;宜丰的宜丰7号、宜丰9号、宜丰4号相近;宜丰6号与宜丰8号相近;金溪2号与金溪3号相近;鄱阳5号与鄱阳7号相近),但并不绝对(如临川1号和上饶鸟柿最相近)。

3 讨论

3.1 IRAP分子标记特别适合于研究种质资源遗传多样性和品种鉴定

在本研究的UPGMA聚类图中,所有供试柿样本被划分成4个群体:柿种群、油柿种群、野柿种群和其他种群,这与邓立宝[18](2014)的研究结果相似。供试样本中的油柿类型虽然在果实大小和形状上有较大不同,但聚类关系很近,说明它们有相同的起源。油柿和柿的亲缘关系较野柿、老鸦柿、金枣柿、君迁子、浙江柿更近,这与耿攀等[19](2010)的研究结果相似。赣方1号是由高安方柿选育出来的少核品种,在聚类图中和高安方柿1号、方柿2号相距较远,可能为枝(芽)变选育而来,形成新品种。杜晓云等(2011)已证明了用IRAP分子标记进行柿品种鉴定的高效性[20],本研究继续支持这一结论。在现有研究报道中,IRAP检测普遍采用琼脂糖凝胶检测,所得指纹图谱的分辨率不高,条带信息量少。本研究通过筛选扩增片段在200～500 bp且多态性好的引物,结合分辨率更高的PAGE检测,提高了条带的分辨率和信息量,指纹图谱更加精细。鉴于本研究结果与前人研究结果的吻合性,我们认为在筛选合适引物的基础上,PAGE凝胶指纹图谱揭示的信息含量更高,更能发挥IRAP分子标记的优势。

3.2 江西柿属资源的遗传多样性丰富

根据文献记录，江西柿属植物有8个种和1个变种[4]。我们资源圃目前收集的江西柿属种质资源共计49份,分属柿、油柿、野柿3个种,遗传相似系数在0.69～0.92之间,表明这些资源具有丰富的遗传多样性。样本中有一些是无核枝(芽)变种,如于都饼柿存在无核枝变,赣方1号为高安方柿少核变异品种,这些均可作为今后新品种选育和基础研究的理想材料。

江西油柿资源很丰富,果形多样,有圆形(油柿1号)、椭圆形(油柿2号)、纺锤形(油柿3号)、扁圆形(最近发现的永修小油柿)等;果个、果重迥异,在我们的调查中,会昌油柿1号果大,果重近200.0 g,而永修的小油柿只有6.5 g左右。聚类分析显示油柿样本间的相似系数在0.695～0.740之间,种内差异比较明显。这些特点为油柿进一步作为单宁专用品种筛选提供了基本材料。

3.3 宜丰10号的原始性

宜丰10号是宜丰县天宝乡的一棵古柿树,据相关部门考证至少有940年树龄。在柿种之中宜丰10号与其它样本的相似性最低(0.740),说明它与其他柿的亲缘关系较远,其在进化上相对原始。我们对宜丰10号生物学特性的观察发现,在其雄花中杂有少量雌花,进一步佐证了其具有相对原始的特性。关于宜丰10号以及其他的江西古柿资源在进化过程中的作用拟进一步开展研究。

图3 供试柿样本的UPGMA聚类分析结果

3.4 江西许多野生柿资源尚未见系统的遗传学研究,有些资源的分类地位模糊,命名不科学

宜丰4号(YES1)和野柿4号(YES4)两个样本,它们和柿种聚类较近而与野柿种相距很远,应该为野生的实生柿种,故不宜编名为野柿种。高安枣柿曾疑为君迁子或与之很相近,但聚类研究表明它与君迁子亲缘关系相距很远,因此,在本研究中应归于柿种,其小果多籽特性在砧木的开发利用方面非常有潜力。

4 结论

IRAP标记技术非常适合于种质资源的遗传多样性分析,通过筛选扩增片段在特定范围且多态性好的引物,并结合PAGE凝胶电泳,能得到分辨率高、信息量更为丰富的指纹图谱,充分发挥IRAP标记的技术优势。

江西柿属种质资源的遗传多样性丰富,有很多地方特色品种,品质优良,如于都盒柿、无核饼柿、高安方柿等。适合的地理位置和地理环境使江西成为柿属资源的重要分布区域,有很多特异的柿种质资源有待进一步调查、挖掘、保护和利用。

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(责任编辑:黄荣华)

Genetic Diversity Analysis ofDiospyrosspp. Germplasm Resources in Jiangxi by Using IRAP Molecular Marker

ZENG Ming, DU Xiao-yun*, WU Mei-hua, WANG Yan-bo

(Institute of Horticultural Science, Jiangxi Academy of Agricultural Science, Nanchang 330200, China)

The genetic diversities of 49 germplasm resources inDiospyrosin Jiangxi were analyzed by using IRAP (Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism) molecular marker. Ten primers which had clear bands and polymorphism in PCR amplification were screened out from 26 IRAP primers, and the PCR-amplified products presented clear fingerprint by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The 418 clear bands (100% diversity) were transformed into 0/1 matrix, and the clustering analysis showed that the genetic similarity coefficients among the tested 49 germplasm resources varied from 0.69 to 0.92, and these germplasm resources belonged to 3 species (DiospyroskakiThunb.,DiospyrosoleiferaCheng, andDiospyroskakivar.silvestisMakino), which revealed abundant genetic diversity. In addition, the species taxonomic relationships among severalDiospyrosspp. germplasm resources were clarified.

Jiangxi;Diospyros; Germplasm resource; Genetic diversity; IRAP

2016-12-23

江西省自然科学基金项目(20151BAB204031);江西省杰出青年科学家资助计划项目(20162BCB23054);江西省科技 支撑计划重点项目(20151BBF60009);江西省农科院创新基金项目(2013CQN003);江西现代农业科研协同创新专项 (JXXTCX2015006-003);江西省农科院科技创新及成果转化基金项目(优势创新团队)(2015CJJ001)。

曾明(1975─),男,助理研究员,硕士,从事果树资源与遗传育种研究。*通讯作者:杜晓云。

S665.2

A

1001-8581(2017)06-0029-06