施树，蒋厚阳，罗章

(1.重庆旅游职业学院，重庆409000；2.西南大学食品科学学院，重庆北碚400700；3.西藏大学农牧学院，西藏林芝860000)

西藏不同地区黑木耳多样性分析

施树1，蒋厚阳2，罗章3*

(1.重庆旅游职业学院，重庆409000；2.西南大学食品科学学院，重庆北碚400700；3.西藏大学农牧学院，西藏林芝860000)

运用酯酶同工酶酶谱分析和ISSR分子标记技术对3株西藏野生黑木耳亲缘性和遗传多样性进行分析。运用丙烯酰胺蛋白电泳技术对野生黑木耳中酯酶同工酶进行电泳；运用PCR-ISSR分子标记技术对野生黑木耳DNA进行随机扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳。用Ntsys 2.10e和PopGen32软件对电泳结果进行聚类和遗传分析。结果表明：3株野生黑木耳中察隅和鲁郎地区样品的亲缘性关系较近，样品间遗传分化指数高。结论：本实验为西藏地区野生黑木耳品种分类、资源保护和新品种培育提供了初步依据。

西藏；野生黑木耳；酯酶同工酶；ISSR

西藏位于我国西南边陲，平均海拔在4000m以上，是青藏高原的主体部分。空气稀薄、气压低、含氧量少、辐射强、日照时间上、日温差大、全年分为明显的干季和雨季。这些气候条件赋予了西藏地区独特的作物资源。黑木耳在真菌学上的分类属担子菌纲，木耳目，木耳科[1]，是人们餐桌上的常见食物，具有丰富的营养。目前还没有人对西藏地区野生黑木耳在基因型上进行研究，运用分子标记技术对物种亲缘关系和遗传多样性进行分析，可以为杂交育种培养新品种提供依据，从而培育出高营养的优势黑木耳菌株。

同工酶电泳技术在生物进化研究中得到广泛地应用，在分子发生、进化、分析标记和遗传上的研究也越来越重要，主要应用于物种鉴定、酶谱鉴定、遗传育种分子标记、群体差异统计等[2-3]。ISSR标记技术由Zietkiewicz等创建，是一种建立在PCR反应基础上的DNA分子标记[4]。广泛地应用于物种鉴定[5]、基因定位[6]、遗传作图[7]、遗传多样性[8]等研究。该技术不需要知道检测物质的基因组序列，操作简单，成本低，灵敏度高[9]。

本研究将酯酶同工酶酶谱分析和ISSR分子标记技术应用于西藏野生黑木耳的基因型研究中，通过丙烯酰胺蛋白电泳对酯酶同工酶酶谱分析，从4种随机引物种选择最佳引物，对野生黑木耳DNA进行随机扩增，通过琼脂糖电泳进行检测。用Ntsys 2.10e，PopGen32软件对电泳图谱进行分析，以探讨西藏不同地区黑木耳之间的亲缘关系，为今后建立野生黑木耳资源库，培育新品种打下基础，同时也探讨酯酶同工酶酶谱分析和ISSR分子标记技术在黑木耳的分类鉴定方面的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株。供试野生黑木耳分别采自西藏亚东、鲁朗和察隅3个地区，菌株的编号为A-C。

1.1.2 试剂。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、蔗糖、溴酚蓝 重庆滴水化学药品责任有限公司；Acrylamide、Bis-acrylamide、过硫酸铵、Glycine TEMED、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、固兰RR盐 上海生工；100bp DNA ladder、Taq酶(5U/uL)、dNTPs(10mmol/L)、10×酶缓冲液、MgCl2(25mM) 宝生物有限公司；1kb DNA ladder、EDTA Na2、Tris-base、Guanidine Thiocyanate、DEPC加拿大BBI；琼脂糖 西班牙Agarose； Gelred核酸染料 美国BIOTIUM。引物合成 上海生工。

1.2 仪器与设备

HB031金属恒温加热器 上海博彩生物技术有限公司；SIM-F140AY65型制冰机 三洋国际贸易有限公司；1-15PK小型台式离心机 德国sigma实验室离心机公司；Biospec-mini型岛津DNA/RNA/蛋白质分析装置，岛津制作所；S1000伯乐 1000系列高性能PCR仪，美国BIO-RAD；164-5050伯乐基础电源电泳仪，美国BIO-RAD；Syngene GeneGenius 凝胶成像系统，基因有限公司；GL-88B涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司； SW-CJ-1F型单人双面净化工作台。

1.3 方法

1.3.1 野生黑木耳酯酶同工酶的提取及电泳。黑木耳酯酶同工酶的提取、电泳和染色参照NY/T 1097-2006[10]中的方法。

1.3.2 野生黑木耳基因组DNA的提取。将干的黑木耳用液氮进行充分研磨，然后参照NY/T 1730-2009[11]中的方法提取样品中的DNA。提取的DNA保存于-20℃冰箱中。测定提取DNA的OD260，OD280及OD260/OD280数值，利用公式c= OD260×50(μg/mL) ×n(稀释倍数)[12]计算出DNA浓度，为后续实验提供数据。

1.3.3 ISSR随机引物的筛选和反应条件的建立。随机引物的筛选：通过对4条不同随机扩增引物(表1)进行PCR反应，根据条带的多态性和亮度选择出最适引物，进行后续实验。

表1 随机引物编号及序列

根据参考文献[13]设定PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；相应褪火温度(表1)1：00min；72℃延伸1：30min；35个循环，然后72℃延伸10min。PCR反应体系为：50ng模板DNA，10×Taq酶缓冲液(无Mg2+)2.5μL，2.5 mM MgCl22.5μL，10mmol/L dNTPs 0.5μL，10μmol/L引物2μL，5U/μL Taq 酶0.2μL。

1.3.4 ISSR扩增产物检测。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。取10μL扩增产物与2μloading buffer混匀，点样于凝胶孔，用1kb DNA ladder作为分子量标尺，电泳缓冲液为1×TAE，70V恒压电泳60min，gelred染色后通过凝胶呈像系统拍照。

1.3.5 酯酶同工酶酶谱和ISSR谱带分析

酯酶同工酶酶谱分析：酯酶同工酶相对迁移率(Rf)[14]：Rf=X2/X1，在式中X1为固定染色前凝胶中指示剂迁移距离，X2为固定染色后凝胶中酶蛋白区带的迁移距离。根据相对迁移率的结果，特定迁移率上无条带赋值为0，有条带赋值为1，用NTsys2.10e制作为“0，1”文件，采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)法进行聚类分析，并构建各菌株的遗传距离聚类图。采用PopGen32软件分析样品的遗传多样性及香农指数等数值。

ISSR分子标记分析：各菌株的电泳图谱上特定位点无条带的赋值为0，有条带的赋值为1，用NTsys2.10e制作为“0，1”文件，采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)法进行聚类分析，并构建各菌株的遗传距离聚类图。采用PopGen32软件分析样品的遗传多样性及香农指数等数值。

2 结果与分析

2.1 酯酶同工酶电泳图

3株西藏野生黑木耳经过PAGE丙烯酰胺电泳后，所有菌株均扩增出明显的条带，个菌株间存在明显的差异性，扩增出的条带的1～4条，Rf值0.4～0.8，其中察隅和鲁郎2个样品的相似条带较多，亚东与察隅和鲁郎没有相似条带。图1显示了三株野生黑木耳的电泳图。

注：A为电泳图，B为模式图

图1 西藏野生黑木耳酯酶同工酶电泳图

2.2 ISSR分子标记电泳图

3株西藏野生黑木耳菌株用P4引物扩增后，所有菌株均扩增出明显的条带，各个菌株之间也存在特异性，扩增出的条带数目在3～4条，所获得的片段分子量大小在250～3000，图2显示了3株野生黑木耳扩增后的电泳图。

注：marker为宝生物有限公司100bp DNA ladder

图2 西藏野生黑木耳ISSR扩增图谱

2.3 聚类分析

用NTsys2.10e软件，对所得扩增图谱的条带进行数据统计处理，分别得出3株野生黑木耳酯酶同工酶和ISSR分子标记后的遗传相似系数矩阵，结果见表2。通过酯酶同工酶分析得到3株野生黑木耳遗传相似系数0.20～0.80，其中鲁郎和察隅之间的相似性系数最大，说明它们之间的亲缘性最近。而亚东与鲁郎、察隅之间的相似性较小，说明它们之间的亲缘性关系较远。 通过ISSR分子标记得到的结果与酯酶同工酶分析得到的结果相近。3株野生黑木耳遗传相似系数0.57～0.86，鲁郎与察隅之间的相似性系数较大，亚东与鲁郎和察隅之间的差异较大。

表2 供试菌株间的遗传相似系数矩阵

图3 西藏野生黑木耳酯酶同工酶分析亲缘关系聚类树状图

图4 西藏野生黑木耳ISSR分析亲缘关系聚类树状图

用NTsys2.10e软件，按照UPMGA法，对供试菌株之间的遗传相似系数矩阵进行聚类分析，得到聚类分析图3和图4。由图3可知，当相似性系数为0.1时，3株野生黑木耳被分为了2组。第一组为亚东地区样品，第二组包括察隅和鲁郎地区样品。由图4可知，当相似性系数为0.64时，3株野生黑木耳被分为了2组，分组的结果同酯酶同工酶分析结果相同。

2.4 遗传多样性分析

采用PopGen32软件分析供试野生黑木耳的遗传多样性和香浓指数等数值。由表3分析可以看出，酯酶同工酶酶谱分析和ISSR分子标记分析所得到的遗传多样性指数和香浓指数都较高，说明西藏野生黑木耳具有很高的遗传分化价值，可以通过杂交育种培育黑木耳新品种。同时也可以看到样品间的多态性位点百分率同样具有很高的数值，这些都表明西藏野生黑木耳间有很高的遗传分化潜力。

表3 西藏野生黑木耳遗传多样性的统计

3 讨论

西藏地区具有由于其独特的气候和地理条件，具有独特的作物资源。黑木耳做为日常饮食中的常见食物，具有很高的研究价值，对其亲缘性和遗传性进行分析，对当地培育黑木耳新品种具有很大的借鉴作用。

目前还没有对于西藏地区野生黑木耳进行分子水平方面研究的报道，所以将酯酶同工酶酶谱分析和ISSR分子标记技术应用于西藏野生黑木耳亲缘性和遗传性分析具有非常重要的意义。国内外很多学者已经将酯酶同工酶酶谱分析和ISSR分子标记技术应用于食用菌分析中。Wang等[15]人运用RAPD和ISSR技术对中国的杏鲍菇基因多样性进行研究。Du等[16]人运用ISSR技术对中国野生毛木耳菌群基因多样性进行了研究。Zhang等[17]人研究了培养时间对于黑木耳酯酶同工酶酶谱的影响。赵勇[18]等人将酯酶同工酶和RAPD技术应用于香菇杂交优势研究中。

本研究探讨了酯酶同工酶酶谱分析和ISSR分子标记技术在西藏野生黑木耳亲缘性和遗传性中的应用。用NTsys 2.10e软件计算出了3株野生黑木耳之间的遗传相似系数矩阵，并用UPMGA法作聚类分析图，用PopGen32软件计算出了3株野生黑木耳之间的遗传多样性数据。综合酯酶同工酶和ISSR分子标记分析，察隅和鲁郎2个地区的样品亲缘性关系较近，3个地区的样品具有很高的遗传分化指数，为培养新型黑木耳杂交品种提供了理论基础。

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Analysis of Genetic Diversity and Relationship of Black Fungus from Different Regions of Tibet

Shi Shu1,Jiang Houyang2,Luo Zhang3*

(1. Chongqing Vocational Institute of Tourism,Qianjiang, 409000;2. Southwest University,Beibei, Chongqing 400700;3. Agriculture and Animal Husbandry College of Tibet University,Linzhi, Tibet 860000)

Analysis genetic diversity and relationship of black fungus from different regions of Tibet by method of esterase isozyme enzyme spectrum and ISSR molecular markers. Using acrylamide protein electrophoresis technology on esterase isozyme of wild black fungus for electrophoresis; take a random amplificatioon of wild fungus by PCR-ISSR molecular marker techonlogy. Conduct product electrophoresis in agarose gel. Clustering and inheritance were analyzed by Ntsys 2.10 and PopGen32 software. Result shows: Samples of Lulang and Chayu have a closer relationship among wild fungus, there is a high genetic differentiation index among samples. This study provides a preliminary basis for species classification and hybrid of wild fungus of Tibet.

Tibet; Black fungus; Esterase isozyme; ISSR

2017-03-07

西藏自治区自然基金资助项目

施树(1978-)，男，讲师，主要从事食品化学与营养学研究，E-mail:shishu1978@163.com；*通讯作者：罗章(1965-)，男，教授，从事农产品加工与贮藏研究。

S646.6

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.03.004