张凤春，费英敏，黄巧莉

(1.铁力市四宝生物科技有限公司，黑龙江铁力152500；2.黑龙江民族职业学院，哈尔滨150066；3.黑龙江生物科技职业学院，哈尔滨150025)

林蛙皮胶原蛋白酸法提取工艺及性质研究

张凤春1，费英敏2，黄巧莉3

(1.铁力市四宝生物科技有限公司，黑龙江铁力152500；2.黑龙江民族职业学院，哈尔滨150066；3.黑龙江生物科技职业学院，哈尔滨150025)

以林蛙皮为原料，研究其胶原蛋白的酸法提取工艺条件, 通过单因素试验及Design Expert软件分析预测，根据生产实际优化调整提取胶原蛋白最优工艺条件为：料液比1∶18，盐酸浓度为0.16mol/L，浸提时间为5h，胶原蛋白提取最大量为28.20%。同时，对林蛙皮胶原蛋白产品进行傅立叶红外转换扫描图谱显示，通过酸法提取的胶原蛋白保存有比较完整的螺旋结构。DSC差热扫描得到酸溶胶原的变性温度为52.4℃，高于猪皮和牛皮胶原的变性温度37℃。

林蛙皮；酸法提取；胶原蛋白

东北林蛙(RanadybowskiiGuenther)[1-2]，俗称田鸡、哈什蟆，属于两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙属(Rana)[3-5]，主要分布于我国东北地区。东北林蛙平均蛋白质占总量的56.3%左右，另外，还含有蛙醇、多糖类、磷脂及多种激素等。现有研究除有关林蛙油的药用及食用等功效外，多偏于对林蛙的保健功能的研究。胶原蛋白是一种天然蛋白质，是由3条肽链拧成的螺旋型纤维状蛋白质，是一种糖蛋白，分子含糖及甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等，是体内含量最多的一类蛋白质，在人体中约占总蛋白质含量的四分之一，存在于几乎所有组织中。酸法提取即利用酸在一定的外界环境条件下提取胶原蛋白，主要采用低离子浓度酸性条件破坏分子间的盐键，而引起纤维膨胀、溶解，作为溶剂使用的酸，主要有盐酸、醋酸、柠檬酸和甲酸等，采用酸法提取的胶原蛋白通常称为酸溶性胶原蛋白。酸溶解法可将没有交联的胶原分子溶解出来，也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法[6-11]。

本研究选取最佳酸种类，通过单因素实验选取对酸法提取胶原蛋白影响显著的因素水平，利用响应曲面分析实验得到林蛙皮酸溶胶原蛋白最佳提取工艺条件。通过紫外扫描、傅立叶红外扫描、变性温度和氨基酸组成分析等对原蛋白性质进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

经过预处理的林蛙皮：实验室自制；氢氧化钠、盐酸、草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、冰乙酸，均为分析纯试剂。HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；721-型紫外可见分光光度计 756P：spectrum；日立835-50型氨基酸分析仪：日本日立公司；凯氏定氮器：上海安亭科学仪器厂；THZ-82A水浴恒温振荡器：江苏荣华仪器制造有限公司；TDL-80-2B离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酸种类的选择

1.2.2 林蛙皮胶原蛋白工艺流程。称取适量经预处理的林蛙皮→恒温浸酸→打浆→均质→水洗→抽滤→离心→干燥

1.2.3 操作要点。首先，选择适量林蛙皮，进行清洗筛选备用。然后，将清选后的林蛙皮加入酸溶液，用保鲜膜封口，在20℃恒温水浴振荡48h，在此期间，每间隔12h更换一次酸溶液以保证酸提取效果。将浸酸后的林蛙皮经均质机均质后，经真空抽滤去除蛙组织，即得粗酸提胶原蛋白溶液，将粗酸提胶原蛋白溶液置于烧杯内不断搅拌，以2.5mol/L NaCl进行盐析1h，经10000r/min高速离心机离心20min，除去上清液，取沉淀于表面皿中，在50℃条件下烘干12h。最终得到的乳白色固体即为酸溶胶原蛋白。

1.2.4 料液比对林蛙皮胶原蛋白提取率的影响。称取适量经预处理的林蛙皮，以不同料液比加入0.1mol/L 的酸溶液，在20℃恒温水浴振荡6h，经均质机均质后，进行抽滤，得到粗酸提胶原溶液，以胶原蛋白提取率作为指标确定料液比。

1.2.5 酸浓度对林蛙残体胶原蛋白提取率的影响。称取适量经预处理的林蛙皮，选取不同浓度的酸溶液，在20℃恒温水浴振荡6 h，经均质机均质后，进行抽滤，得到粗酸提胶原溶液，以胶原蛋白提取率作为指标确定酸浓度。

1.2.6 酸提时间对林蛙残体胶原蛋白提取率的影响。称取适量经预处理的林蛙皮，在20℃恒温水浴振荡不同时间，经均质机均质后，进行抽滤，得到粗酸提胶原溶液，以胶原蛋白提取率作为指标确定提取时间。

1.2.7 响应曲面试验分析。应用Design-Expert 7.0.0 Trial软件，以每组试验中林蛙皮酸法提取的胶原蛋白提取率为指标，进行响应曲面分析。得到酸法提取林蛙皮胶原蛋白的最佳工艺条件。响应曲面试验因素水平及编码表见表1。

表1 酸法提取林蛙皮胶原蛋白实验因素水平及编码表

1.3 酸法提取林蛙皮胶原蛋白性质研究

1.3.1 紫外扫描(UV spectra)分析。采用紫外分光光度计在190～400nm进行扫描0.3g/L的胶原乙酸溶液。

1.3.2 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析。将一定量干燥的KBr和胶原蛋白冻干品至于玛瑙研钵中，研磨均匀，成粉末状，装样，手动压片，取出样品小心放入样品室。采用Nicolet-SX-170傅立叶红外光谱仪对样品在400cm-1～4000cm-1扫描，扫描信号累加200次，分辨率为4cm-1。

1.3.3 变性温度的测定。将装有0.3g/L的胶原乙酸溶液的乌氏粘度计浸入水浴中[7],测定胶原溶液流经毛细管的时间。水浴温度自15℃上升至188℃，每个测定温度稳定2min。

相对黏度(Relative viscosity)= ηr= 样品流动时间 / 空白流动时间

增比黏度(Specific viscosity)= ηsp= (η-η0) / η0= ηr-1以变性温度变化对增比黏度作图，在增比黏度变化曲线上取其变化一半的温度作为胶原的变性温度。

1.3.4 氨基酸组成分析。取适量提取得到的胶原蛋白样品，在减压充氮条件下用6mol/L HCl于110℃水解24h。采用日立835-50型氨基酸分析仪对样品进行检测，茚三酮显色，对生成紫色化合物的常规氨基酸在570nm检测；对形成黄色产物的脯氨酸和羟脯氨酸在440nm检出。

2 结果与分析

2.1 酸种类的选择

图1 不同种类酸溶液对林蛙皮胶原蛋白的提取效果比较

由图1可知，在上所述操作条件下，盐酸对林蛙皮中胶原蛋白的提取效果最佳，胶原含量明显高于其他酸种类，因此，选取盐酸作为酸法提取林蛙皮胶原蛋白的提取剂。

2.2 酸法提取林蛙皮胶原蛋白工艺单因素实验结果

2.2.1 料液比对林蛙皮胶原提取率的影响

图2 不同料液比的林蛙皮胶原蛋白提取率

从图2知，当料液比为1∶20时林蛙残体胶原蛋白提取率最高，随着料液比的增大，羟脯氨酸含量降低，这是由于料液比越大，溶液中的羟脯氨酸浓度则越低的缘故，并不能说明此时OD值大提取效果就好。应通过计算酸粗提液中的胶原含量，并计算得出该料液比下的胶原蛋白提取率，通过提取率的大小确定1∶20为酸法提取林蛙残体胶原蛋白的最佳料液比。

2.2.2 酸浓度对林蛙皮胶原提取率的影响

图3 不同酸浓度的林蛙皮胶原蛋白提取率

从图3中可知，随着盐酸浓度的增加，林蛙皮中胶原蛋白的溶出量明显增多，从而胶原蛋白的提取率不断增加，但酸浓度不可过高，否则会影响所提取的胶原蛋白的纤维结构。当盐酸浓度由0.15mol/L升至0.20mol/L过程中，胶原蛋白提取率明显增加，继续加大浓度，则胶原蛋白提取率增加平缓，因此选取0.20mol/L作为提取林蛙皮胶原蛋白的适宜盐酸浓度。

2.2.3 酸提时间对林蛙皮胶原提取率的影响

图4 酸提时间的林蛙皮胶原蛋白提取率

从图4可知，随着提取时间的延长，盐酸溶液对林蛙皮胶原蛋白的提取率明显递增，在4～5 h内增加最明显，5h后，随着时间的延长，盐酸溶液对林蛙皮胶原蛋白的提取率继续增加，但增加趋势低于5h，因此，选取5h为盐酸溶液提取林蛙皮胶原蛋白的适宜时长。

2.2.4 响应曲面试验设计及结果分析

在上述单因素实验基础上进行响应曲面实验设计[12]，确定盐酸提取林蛙皮胶原蛋白最优工艺条件。利用Design Expert软件，采用中心组合实验Box-Behnken设计方案[13]，以料液比、盐酸浓度、浸提时间对工艺参数进行优化。

表2 响应曲面分析实验点安排及实验结果

设该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可表达为：

Y = C0+ C1A + C2B + C3C + C12AB + C13AC + C23BC + C11A2+ C22B2+ C33C2

(1)

式中，Y为预测相应值，C0为常数项，C1、C2、C3分别为线性系数，C12、C13、C23为交互项系数，C11、C22、C33为二次项系数。为了确立二次多项方程(1)，利用Design Expert软件进行实验设计和数据分析。设计方案及结果见表2。

利用Design Expert软件进行多元回归拟合，获得酸法提取林蛙皮胶原蛋白提取率对编码自变量料液比、盐酸浓度、浸提时间的二次多项回归方程：

Y = 27.46-3.52A-2.20B + 0.62C-0.12AB-1.07AC-2.15BC-10.21A2-3.26B2-7.84C2

表3为二次多项模型方差分析表。

表3 二次多项模型方差分析表

其模型的F值为44.14，说明该模型有意义。其中A、B、BC、A2、B2、C2这几项为显著性的模型项。而此概率大于0.1即说明该模型项对于模型影响不显著，可以根据实际情况进行分析调整。

失拟项的F值为30.82，说明失拟项相对于误差项来讲不显著，该失拟项说明模型的拟合性非常好，可以用于模型分析。其中预测系数为0.7333，相对于校正决定系数的0.9604而言拟合度好，决定系数为0.98277，说明该模型的拟合性非常好，可以用于模型分析。本模型的信噪比达到8.99，说明该模型可以用于生产应用当中。

通过Design Expert软件分析，得出最优条件为：料液比1∶18，盐酸浓度为0.16mol/L，浸提时间为5～10h，该条件下酸法提取林蛙皮胶原蛋白提取率的预测值为28.20%。考虑实际生产条件，将此条件优化为：料液比1∶18，盐酸浓度为0.16mol/L，浸提时间为5h。

2.3 林蛙皮酸溶胶原蛋白的性质研究

2.3.1 傅立叶红外扫描。林蛙皮酸溶胶原的傅立叶红外转换扫描图谱见图5～6。酰胺A出现于3400cm-1左右，是N-H伸缩振动的吸收峰，表明氢键的存在。酰胺B出现于3080cm-1，这是胶原在扫描中通常出现的波长[17]。酰胺I出现在1640cm-1，酰胺II在1585cm-1，酰胺III在1257cm-1，它们各自表示C=O的伸缩振动，N-H的弯曲振动和 C-H的伸缩振动[18]。酰胺I和蛋白质的二级结构有关，酰胺III证明了螺旋结构的存在[19-20]。因此，傅立叶红外转换扫描证明了实验制取的林蛙皮酸溶胶原保存有比较完整的螺旋结构。

图5 酸溶胶原的傅立叶红外转换扫描图谱

2.3.2 变性温度的测定。如图6所示，盐酸提取林蛙皮中的胶原蛋白的变性温度为52.40℃，高于猪皮和牛皮胶原变性温度37℃，这表明提取林蛙油后的剩余林蛙皮具有替代高等陆生脊椎动物作为胶原蛋白来源潜力[21]。

图6 酸溶胶原热变性曲线

3 结论

通过单因素试验及DesignExpert软件分析，酸法提取林蛙残体胶原蛋白优化条件为：料液比1∶18，盐酸浓度为0.16mol/L，浸提时间为5h，该条件下胶原蛋白提取最大量为28.20%。

傅立叶红外扫描发现提取得到的胶原中，酰胺I和蛋白质的二级结构有关，酰胺III证明了螺旋结构的存在。因此，傅立叶红外转换扫描证明了实验制取的林蛙残体酸溶胶原保存有比较完整的螺旋结构。经测定，林蛙残体的变性温度为52.40℃，这表明提取林蛙油后的剩余林蛙残体具有替代高等陆生脊椎动物作为胶原蛋白来源的潜力。

[1]李宜平,张晋纲,刘淼,等.哈蟆油动物基原问题探讨[J].中国中药杂志,2003,28 (1):836-837.

[2]谢锋,松井正文.中国东北地区林蛙属物种的分类学研究(两栖纲:蛙科)[J].动物分类学报,1999,24(2):224-231.

[3]肖井雷,姜大成,刘玉翠.蛤蟆油的原动物分类阶元探讨[J].长春中医学院学报,2005,21(2):40,64.

[4]胡晓丹,李波.哈士蟆的价值及利用[J].中国食物与营养,2001(2):27-28.

[5]王宇,尚德静,冯伯森.中国林蛙蛙卵营养成分分析[J].辽宁师范大学学报(自然科学版),2004,27(4):471-473.

[6]朱瑞霞,施溯箔.冰乙酸和胃蛋白酶依次提取新鲜林蛙皮胶原蛋白[J].延边大学学报(自然科学版),2013,39(3):202-205.

[7]康岚,姚霞,朱健勋,等.林蛙皮中胶原蛋白的含量测定研究[J].吉林中医药,2014,34(10):1011-1013.

[8]J.H.Muyonga,C.G.B.Cole,et al.Characterisation of acid solubie collagen from skins of young and adult Nile perch[J] .Food Chemistry,2004,85:81-89.

[9]Wang Lin, Liang Qiufang,Chen Tingting,et a1.Characterization of collagen from the skin of Amur sturgeon (Acipenser schrenckii)[J]. Food Hydrocolloids,2014,38:104-109.

[10]Onouma Kaewdang,Soottawat Benjakul,Thammarat Kaewmanee,et al.Characteristics of collagens from the swim bladders of yellowfrn tuna(Thunnus albacares)[J].Food Chemistry,2014,155(155):264-270.

[11]张强,王倩倩,陆剑锋,等.不同方法提取鲍鱼皮胶原蛋白的理化特性比较[J].现代食品科技，2014,30(5):104-110.

[12]盖钧镒.试验统计方法[M].北京:中国农业出版社,2004.

[13]黄璞,谢明勇,聂少平,等.响应曲面法优化微波辅助提取黑灵芝抱子多糖工艺研究I[J].食品科学,2007(10):200-203.

[14]Lin Yung-kai,Liu Deng-cheng.Comparison of pysical-chemical properties of typeⅠcollagen from different species[J].Food Chemistry,2006,99:244-251.

[15]崔潇,江虹锐,刘小玲,等.响应面法优化罗非鱼鱼皮胶原多肤鳌合镁的工艺条件的研究[J].食品工业科技，2013,34(15):238-245.

[16]李亚娜,林永成,佘志刚.响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工艺[J].华南理工人学学报(自然科学版),2004,32(11):28-32.

[17]Wu Hui., Chun, Chen Hua., Ming, Shiau., Chyuan Yuan. Free amino acids and pep tides as related to antioxidant p roperties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) [J].Food Research International, 2003,36(9-10):949-957.

[18]Senji Sakanaka, Yum i Tachibana, Noriyuki Ishihara, and Lekh Raj Juneja. Antioxidant Properties of Casein Calcium Peptides and Their Effects on Lip id Oxidation in Beef Homogenates [J].J Agric Food Chem,2004,21:1-5.

[19]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2000.

[20]Eresha Mendis[Eresha Mendis, Niranjan Rajapakse, Hee-Guk Byun,Se-Kwon Kim.Investigation of jum bo squid (Dosidicus gigas) skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects[J]，Life Sciences,2005,77:2166-2178.

[21]T akeshi Nagai, Nobutaka Suzuki. Isolation of collagen from fish wastematerial- skin,bone and fins[J].Food Chemistry,2000,68:277-281.

Study on Extraction Technology and Properties of Collagen fromRanachensinensis

Zhang Fengchun1, Fei Yingmin2, Huang Qiaoli3

(1. Tieli City Sibao Biological Technology Co. LTD., Tieli 152500; 2. Heilongjiang Vocational College for Nationalities,Harbin 150066; 3. Heilongjiang Vocational College Of Biology Science And Technology , Harbin 150025)

This thesis is to extract collagen from the remainingRanachensinensisskin, and to study the collagen by acid extraction and enzymatic extraction process. Through analyzing and forecasting by the single-factor test and Design Expert software, according to the actual , the optimum process condition of products are: solid-liquid ratio 1∶18, hydrochloric acid concentration of 0.16mol/L, extraction time of 5h , the maximum amount of collagen extraction was 28.2%. Fourier transformation infrared scan patterns showed that acid extraction of the products, the experiments proved the system to take the acid-soluble collagen is the preservation of the original spiral structure completely. DSC scanning results showed that the acid-soluble collagen of original protein denaturation temperature is 52.4℃,which is more than the skin and cowhide collagen denaturation temperature of 37℃.

Ranachensinensisskin; Acid extraction; Collagen protein

2017-03-16

黑龙江省省院科技合作项目(hz201309)

张凤春(1972-)，男，经济师，研究方向为林蛙产品的开发研究，E-mail：tlsibao@126.com。

S966.3+5;R284.2

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.03.001