林榕燕 钟淮钦 叶秀仙 黄敏玲

摘 要 为研究磷酸甘露糖变位酶基因（PMM）的功能及其在多糖生物合成中的表达调控机制，以霍山石斛原球茎为材料，利用RT-PCR技术，克隆PMM基因，对其 cDNA序列和表达情况进行分析。结果显示：霍山石斛PMM基因cDNA序列长949 bp，包含一个747 bp的开放阅读框，共编码248个氨基酸，GenBank中的登录号为KY912084。生物信息学分析表明：该蛋白属于HAD超家族，可能是一种稳定的、不具有信号肽和跨膜结构的亲水蛋白。系统进化树分析表明，霍山石斛PMM与铁皮石斛、海枣、油棕、芦笋亲缘关系较近，处于同一分支。qPCR结果显示：PMM基因在茎中的相对表达量最高；在4种不同药用石斛比较中，鼓槌石斛的相对表达量最高，霍山石斛的表达量最低。本研究结果表明PMM基因可能不仅参与到石斛多糖的合成，还与其它化合物的生物合成相关。

关键词 霍山石斛；PMM基因；克隆；qPCR

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract In the stusy， the cDNA sequence of PMM gene was isolated from the protocorm by RT-PCR， and its expression level was analyzed to elucidate the function of phosphomannomutase gene and its role during polysaccharides biosynthesis. The results showed that the length of PMM gene（accession number was KY912084 in GenBank）was 949 bp， containing a 747 bp open reading frame encoding 248 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein belonged to HAD superfamily and might be a kind of hydrophily and stable protein， which had no signal peptide and transmembrane structures. The phylogenetic tree analysis showed that the protein had closer relationship with Dendrobium catenatum， Phoenix dactylifera， Elaeis guineensis and Asparagus officinalis， which at the same branch. qPCR results indicated that PMM gene was highly expressed in the stem and the relative expression of PMM gene was the highest in Dendrobium chrysotoxum and the lowest in Dendrobium huoshanense in the comparison of the four different medicinal dendrobium. The results suggested that PMM gene may not only be involved in the synthesis of dendrobius polysaccharide， but also related to the biosynthesis of other compounds.

Key words Dendrobium huoshanense； PMM gene； cloning； qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.020

霍山石斛（Dendrobium huoshanense），又名米斛，是蘭科石斛属多年生草本植物，更是众多保健药品和保健食品的主要来源之一[1-3]，是石斛属植物中药用价值较高的一种石斛[4]。由于霍山石斛对生长环境要求十分苛刻，自然繁殖效率极低，加上人工的长期采挖，其野生资源已难觅踪迹[5]。基因工程技术能够为植物的改良提供理论依据和物质基础，近几十年来，对霍山石斛进行了大量的研究，特别是组织培养技术取得了较大的进展[6-7]，但在基因工程研究方面，有关霍山石斛的报道还较少。石斛多糖是石斛属植物的主要有效成分之一[8-9]，因此通过基因工程手段提高石斛多糖的含量具有重大意义。

石斛中的多糖主要由葡萄糖和甘露糖等单糖组成，从兜唇石斛中提取的多糖AP-l、AP-2和AP-3为β（l→4）连接的直连D-葡萄甘露聚糖[10]；密花石斛中分离得到的均一多糖DDP-1-D也被证实为葡萄甘露聚糖，主要由D-葡萄糖和D-甘露糖按3.01 ∶ 1的比例组成[11]；从流苏石斛分离获得的3种均一性多糖，经结构鉴定发现这3种多糖都是由葡萄糖和甘露糖按不同比例构成的[12]；袁晨琳[13]从霍山石斛中分离得到七种组分多糖，它们均由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以不同的摩尔比组成。磷酸甘露糖变位酶（Phosphomannomutase，PMM）属于一类新型的磷酸转移酶，能够催化D-甘露糖-6-磷酸和D-甘露糖-1-磷酸之间的相互转变，为合成GDP-甘露糖提供底物[14]。而GDP-甘露糖作为甘露糖供体参与到抗坏血酸、细胞壁多糖、含甘露糖的多糖、糖基化蛋白、褐藻胶和岩藻聚糖等的生物合成中[15-18]。目前有关磷酸甘露糖变位酶的研究在真菌[19-21]、动物[22-23]、植物[24-25]中均有报道，但在霍山石斛中还未见任何报道。本研究以霍山石斛原球茎为材料，克隆了PMM基因，对其cDNA序列进行分析，并利用qPCR技术检测了霍山石斛不同组织及不同品种药用石斛中PMM基因的表达情况，为后续研究磷酸甘露糖变位酶的功能以及石斛多糖合成代谢提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取继代培养50 d的生长旺盛的霍山石斛原球茎为材料，用于基因克隆；选取继代培养120 d的霍山石斛试管苗中的茎、叶、根以及4种不同药用石斛（霍山石斛、金钗石斛、铁皮石斛、鼓槌石斛）的试管苗为试验材料，用于定量表达分析。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 采用通用植物总RNA提取试剂盒对供试材料进行总RNA的提取，并进行试验所需的cDNA的合成。除5′RACE外，其它步骤中所用cDNA的合成都是采用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，按说明书进行具体操作步骤，采用AP接头作为引物进行逆转录，5′RACE 所需cDNA的逆转录是在反转录的cDNA第一链基础上进行纯化和加尾。

1.2.2 引物设计及PCR扩增 利用NCBI数据库中植物相关的PMM核酸序列信息，完成PMM基因保守区引物的设计。而后根据PMM基因保守区的测序结果设计3′RACE和5′RACE 所需要的引物。然后拼接所获的的各片段序列，设计一对引物用于ORF的扩增。本试验所用的各项引物见表1。PCR扩增反应及后续步骤参照樊荣辉等[26]的试验方法进行。

1.2.3 生物信息学分析 参照林榕燕等[27]的分析方法，利用ExPASy软件、CBS Prediction Servers软件、Conserved Donain Search软件、PSORT软件以及PredictProtein软件进行蛋白理化性质和结构特征分析，并利用MEGA5.0软件（Neighbor-Joining，邻位相连法）进行系统进化树的构建。

1.2.4 霍山石斛PMM基因定量表达分析 本研究采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂（Takara）和ABI7500实时荧光定量PCR仪器（美国ABI公司），以18S rRNA作为参照基因，依据荧光引物设计原则，设计定量引物PMM-RT-F和PMM-RT-R用于PMM的qPCR扩增，检测PMM基因在霍山石斛不同组织以及不同品种药用石斛试管苗中的表达情况。每个反应包括3个重复，具体操作流程参照林榕燕等[27]的研究。

2 结果与分析

2.1 霍山石斛PMM基因cDNA序列的获得

通过PMM基因保守区的PCR扩增，获得一条455 bp的特异性条带，片段大小与预期一致。而后进行5′RACE和3′RACE扩增，分别得到174 bp和503 bp的条带，与预计的一致。将以上的3段序列进行拼接，得到长为949 bp的PMM核酸序列。应用ORF扩增引物（表1）验证得到一条786 bp的特异性条带（图1）。测序结果经检索，与其它植物有较高的同源性，说明本研究克隆得到的确实是霍山石斛PMM基因序列。该序列长949 bp，包含一个完整的共747 bp的ORF（6-752），编码248个氨基酸，以及5 bp的5′UTR，197 bp的3′UTR（含poly A）。该基因在GenBank上的登录号为KY912084。PMM基因cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列见图2。

2.2 霍山石斛PMM基因编码蛋白质理化性质和结构特征分析

利用ProtParam软件和ProtScale软件对霍山石斛PMM蛋白质理化性质分析的结果显示，该蛋白的分子式为C1 275H1 977N327O376S8，由20种共248个氨基酸组成，分子量为28 159.17，原子总数为3 963。预测结果还显示该蛋白不稳定系数为37.98，推测该蛋白是一个稳定蛋白；总平均疏水指数为-0.289，疏水性最高值2.122出现在第39个氨基酸处；亲水性最强值-2.956出现在第139个氨基酸处；故推测该蛋白为亲水性蛋白。

信号肽、跨膜结构及卷曲螺旋的预测结果表明：霍山石斛PMM的C值、Y值、以及D值均小于0.5，且从N末端开始的前60个氨基酸期望值为0.000 34，小于10，由此看出，霍山石斛PMM蛋白不含有信号肽。PMM蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值为0.001 71，远小于18，推测该蛋白不具有跨膜结构。PMM蛋白在值窗口值为14，21和28时形成卷曲螺旋的预测概率均远低于0.5，预测该蛋白无法形成卷曲螺旋结构。

蛋白质的功能与其亚细胞定位有着紧密的相关性，对霍山石斛PMM蛋白的亚细胞定位的预测结果表明：该蛋白定位于微体的可能性最大，为57.2%；定位于细胞质的可能性为45.0%；定位于线粒体基质的可能性较低，为10.0%。

通过分析霍山石斛PMM蛋白的保守结构域，结果发现该蛋白属于HAD超家族，还含有植物PMM蛋白特有的3个保守的结构域：保守序列为DXDXTLX的区域Ⅰ、保守序列为DKTY的结构域Ⅲ以及保守序列为[GSTDE][DSEN][DSENVG]的区域Ⅳ。这些保守結构域的存在是霍山石斛PMM蛋白行驶其功能所必须的。

对霍山石斛PMM蛋白的二级结构进行分析，结果显示PMM的二级结构由39.92%的螺旋结构、36.29%的卷曲结构以及23.79%的折叠结构组成。利用SWISS-MODEL软件，以5ue7.1.A为模板，预测霍山石斛PMM蛋白的三维结构，结果见图3。从图中可以看出该蛋白的主要结构元件还是螺旋、折叠和卷曲，与二级结构的预测结果相符。

2.3 霍山石斛PMM蛋白同源性和进化分析

选取包括霍山石斛（Dendrobium huoshanense，KY912084）在内的7种不同物种的氨基酸序列，利用DNANAN软件进行序列多重比对分析。分析结果表明，不同植物的PMM之间具有较高的一致性，达到88.41%。同时发现，霍山石斛PMM的功能域氨基酸组成与其它植物几乎一致，即都含有保守序列为DXDXTLX的区域Ⅰ、保守序列为XXSX的结构域Ⅱ、保守序列为DKTY的结构域Ⅲ以及保守序列为[GSTDE][DSEN][DSENVG]的区域Ⅳ（图4方框所示）。

根据NCBI Blast比对结果显示，PMM cDNA核酸序列推导的氨基酸序列与其它植物的同源性均较高，与铁皮石斛（Dendrobium catenatum，AHY34917.1）的同源性最高，为99%。其它依次为：木本棉（Gossypium arboreum，XP_017616871.1）和黄麻（Corchorus capsularis，OMO78718.1）的88%，蘆笋（Asparagus officinalis，XP_020274219.1）和葡萄（Vitis vinifera，XP_002267677.1）的87%，海枣（Phoenix dactylifera，XP_008806840.1）和油棕（Elaeis guineensis，XP_010934857.1）的86%，玉米（Zea mays，NP_

001140792.1）、短花药野生稻（Oryza brachyantha，XP_006653042.2）、小米（Setaria italica，XP_004960027.1）以及马铃薯（Solanum tuberosum，XP_006345602.1）的84%，二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003580842.1）、碧桃（Prunus persica，XP_007221006.1）和大叶藻（Zostera marina，KMZ62827.1）的83%。

以包括霍山石斛PMM的编码蛋白在内15种不同物种的PMM氨基酸序列为模板，构建PMM的系统进化树，进化树中数字代表Bootstrap值。从进化树结果（图5）可以看出，序列被分为2个大的分支，包括霍山石斛在内的5种单子叶植物为一个分支；其它10种植物为另一分支，该分支中又可分为2大类，分别为单子叶和双子叶植物。值得注意的是单子叶植物大叶藻被划分到双子叶植物这一类别，说明大叶藻的PMM氨基酸序列与双子叶植物较为接近。霍山石斛PMM首先与铁皮石斛、海枣、油棕、芦笋处于同一分支，与它们的亲缘关系较近，其次是另一分支中的单子叶植物包括玉米、短花药野生稻、二穗短柄草和小米。

2.4 定量表达分析

为了解PMM基因在霍山石斛不同组织中的表达水平，选取茎、根、幼叶及成熟叶为材料，以18S rRNA为参照基因，不同组织中的相对表达量见图6。从图中可以看出，霍山石斛PMM基因的相对表达量高低依次为茎> 成熟叶> 根> 幼叶。运用SPSS软件分析发现，幼叶与其它3种组织间的相对表达量存在显著性差异。

利用qPCR技术检测PMM在4种不同药用石斛，霍山石斛、金钗石斛、铁皮石斛和鼓槌石斛试管苗中的表达情况，结果显示PMM基因在不同石斛品种中的相对表达量大小依次为鼓槌石斛、金钗石斛、铁皮石斛和霍山石斛，且各品种间的相对表达量存在显著差异。

3 讨论

本试验从霍山石斛原球茎中克隆得到PMM基因，其编码248个氨基酸，与大部分真核生物中的 PMM长度相似。通过BLAST比对，发现该氨基酸序列与铁皮石斛、木本棉、黄麻、芦笋、葡萄、海枣、油棕等植物有很高的同源性，基本都在80%以上。蛋白质作为生命活动的主要承担者，对其氨基酸序列的结构和功能进行预测与分析，可以为阐明生命现象的本质奠定理论基础。本研究利用软件对霍山石斛PMM蛋白进行理化性质和结构特征分析，发现该蛋白属于亲水性、稳定性、不含信号肽和跨膜结构的蛋白，属于 HAD 超家族的成员。HAD 超家族是一个巨大的蛋白家族[28]，其中包括各种各样的酶，数量庞大，如磷酸甘露糖变位酶、磷酸酯酶以及脱卤酶等，涵盖了众多代谢途径。该家族有4个极为保守的基序，其中motif I的保守序列为D x x x[TV]，第一个天冬氨酸可作为必要的Asp亲核试剂；motif II的保守序列为[S/T]，其中的氨基酸残基可通过氢键结合到底物的磷酸基团；motif III和motif Ⅳ保守序列分别为DKTY和[GSTDE][DSEN][DSENVG]，参加到 ASP亲核剂对底物磷酸基团的定向，并能够结合Mg2+[29]。本研究所克隆得到的PMM基因序列与其它植物相比，具有较强的保守性，也表明本次试验的可靠性。

磷酸甘露糖变位酶能够催化D-甘露糖-6-磷酸和D-甘露糖-1-磷酸之间的相互转化，一定程度上为GDP-甘露糖的合成提供前体物质。有研究证明该基因还参与抗坏血酸、含甘露糖的多糖、糖基化蛋白等的生物合成。经由农杆菌介导方法，将水稻PMM基因（OsPMM）转入到粳型三系恢复系C418中，结果发现其在转基因植株中的相对表达量明显提高，相应地，抗坏血酸含量也有所提升[30]。在本氏烟中对PMM基因进行病毒诱导的基因沉默研究发现，减量表达该基因，叶片中维生素C的含量降低了；同时过表达该基因则可以提高叶片中维生素C的含量[14]。通过构建铁皮石斛[31]PMM超表达载体，并对其进行功能验证，结果显示，相较于对照植株，转基因拟南芥植株中的抗坏血酸含量和多糖含量均有明显增加，说明铁皮石斛PMM基因与抗坏血酸和多糖合成代谢有关。系统进化树结果显示霍山石斛PMM与铁皮石斛PMM的亲缘关系最近，推测二者之间的功能具有一定的相似性，说明霍山石斛PMM可能参与到抗坏血酸和多糖生物合成代谢中。

为探究PMM基因在霍山石斛多糖合成中的作用，本研究通过定量表达分析发现霍山石斛PMM基因在茎中的相对表达量最高，且成熟叶的相对表达量高于幼叶；这与铁皮石斛PMM在营养生长和生殖生长阶段的茎中均高度表达的结果基本一致[31]。结合金海英等[32]对霍山石斛多糖含量变化规律的研究发现，随着培养周期的延长，多糖含量逐渐增加；以及基于茎是石斛多糖存储的主要部位这一认知，推断PMM基因可能与石斛多糖的生物合成相关。通过对不同药用石斛品种中PMM基因的相对表达量比较发现，鼓槌石斛的表达水平明显高于金钗石斛、铁皮石斛和霍山石斛。而王再花等[33]对35种石斛材料的多糖含量测定发现，与鼓槌石斛和金钗石斛相比较，铁皮石斛的多糖含量遥遥领先。郑志新等[34]的研究也证明了鼓槌石斛的多糖含量低于铁皮石斛。由此推测，PMM基因不仅参与到石斛多糖的合成，还可能与其它化合物的生物合成相关。因此，霍山石斛PMM基因的克隆与表达分析，将有助于该基因的功能及石斛多糖生物合成的进一步研究。

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