崔玉环,董利平，赵宝民,连晶晶,谷 伟,杨继雷,刘占矿,魏玉磊

(1.河北北方学院附属第一医院老年科，河北 张家口 075000; 2.河北北方学院附属第一医院检验科，河北 张家口 075000; 3.河北北方学院附属第一医院心外科，河北 张家口 075000)

柴胡皂苷d联合黄芩苷对脑缺血再灌注损伤大鼠抗氧化酶的影响

崔玉环1,董利平1，赵宝民1,连晶晶2,谷 伟1,杨继雷1,刘占矿1,魏玉磊3

(1.河北北方学院附属第一医院老年科，河北 张家口 075000; 2.河北北方学院附属第一医院检验科，河北 张家口 075000; 3.河北北方学院附属第一医院心外科，河北 张家口 075000)

目的 探讨柴胡皂苷d联合黄芩苷对脑缺血/再灌注损伤大鼠抗氧化酶的作用。方法 雄性SD大鼠60只，采用线栓法制备脑缺血再灌注模型，按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组、柴胡皂苷d组(70 mg·kg-1)、黄芩苷组(30 mg·kg-1)、柴胡皂苷d(70 mg·kg-1)+黄芩苷组(30 mg·kg-1)，缺血/再灌注后，每天腹腔注射一次，连续给药7 d后，检测大鼠神经功能损伤评分，检测脑组织、血清中丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX))的活性。结果 与假手术组比，模型组大鼠神经功能损伤评分显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；药物组神经功能损伤评分显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与假手术组相比，模型组脑组织、血清中MDA含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)，CAT、SOD、GSH-PX活性降低，差异有统计学意义(P<0.01)；药物组脑组织、血清中MDA含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，CAT、SOD、GSH-PX活性增强，差异有统计学意义(P<0.05)。柴胡皂苷d(70 mg·kg-1)+黄芩苷组(30 mg·kg-1)抗氧化酶作用显著。结论 柴胡皂苷d联合黄芩苷对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用可能通过抗氧化作用实现。

柴胡皂苷d；黄芩苷；脑缺血/再灌注；抗氧化酶

脑血管疾病最为常见的是缺血性脑血管病，治疗过程中首要恢复血流供应，但会带来再灌注损伤，其发病机制包括氧化应激[1]、炎症反应、能量耗竭[2]、兴奋性氨基酸和细胞凋亡[3]等，目前研究主要集中在氧化应激机制，再灌注后自由基过多，抗氧化酶不能及时清除过量的自由基，导致神经元过度损伤或者凋亡[4]，损伤脑功能。如何提高脑内抗氧化酶活性及清除过量自由基是减少缺血再灌注损伤的方法。现代药理研究发现黄芩苷对脑损伤具有保护作用[5]。本研究探讨了柴胡皂苷d联合黄芩苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织、血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)的活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

SD大鼠60只，雄性，体质量(240±5) g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物合格证号:SCXK(京)2006-0008。自由饮水，饲养条件：室温(22.0±1.0) ℃，湿度40%。所有实验程序都按照国立实验室动物的护理和使用健康指南进行。

柴胡皂苷d，黄芩苷由Sigma-Aldrich公司提供；MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、CAT测定试剂盒、GSH-PX测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备

60只SD大鼠按随机数字法分为正常对照组、假手术组、模型组、柴胡皂苷d组(70 mg·kg-1)、黄芩苷组(30 mg·kg-1)、柴胡皂苷d(70 mg·kg-1)+黄芩苷组(30 mg·kg-1)，每组10只。大鼠称重后，7%水合氯醛(5 mL·kg-1)腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，采用改进Longa线栓法，制备右侧大脑中动脉脑缺血/再灌注大鼠模型，2 h后拉出栓线，恢复血液供应。假手术组只暴露颈总动脉，不导致血流阻塞。各药物组每天腹腔注射一次，连续给药7 d，正常对照组和假手术组腹腔注射同体积生理盐水。实验过程中大鼠均不应用抗生素，死亡3只，其中模型组1只，黄芩苷组2只，在普通喂养内死亡，其他组无死亡，已及时补充，新补充大鼠与实验所用大鼠差异无显著性。

1.2.2 神经行为学评分

大鼠苏醒后，观察存活大鼠行为变化，于给药7 d后采用双盲法参考Clark 评分标准评分(0～28分)[6]。

1.2.3 取材和抗氧化酶指标检测

给药7 d后，取大鼠腹主动脉血5 mL，肝素钠注射液抗凝，放入10 mL离心管中，4 ℃ 11 000 rpm离心10 min，吸取上清液，放入-20 ℃中待测，再立即处死大鼠，放置于冰盒上，取出缺血侧脑组织，用预冷生理盐水除去样本表面凝血等附属物，滤纸吸干表面水分，加生理盐水制成10%的脑匀浆，4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，放入-20 ℃中待测。上述血清和组织样本依次按照试剂盒方法测定MDA含量和CAT、SOD、GSH-PX活性。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 神经功能损伤评分

正常对照组与假手术组神经功能损伤评分差异无统计学意义(见图1)。与假手术组相比，模型组神经功能损伤评分显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组神经功能损伤评分显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与柴胡皂苷d+黄芩苷组比，柴胡皂苷d组和黄芩苷组神经功能损伤评分较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与假手术组比较**P<0.01；与模型组比较##P<0.01；与柴胡皂苷d+黄芩苷组比较△P<0.05。

2.2 脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织和血清中MDA含量变化

正常对照组与假手术组小鼠血清和脑组织中MDA含量差异无统计学意义；与假手术组相比，

模型组小鼠血清和脑组织中MDA含量显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比，柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组血清和脑组织中MDA含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与柴胡皂苷d+黄芩苷组比，柴胡皂苷d组和黄芩苷组血清和脑组织中MDA含量较高，差异有统计学意义(P<0.05)。表明柴胡皂苷d、黄芩苷可降低小鼠血清和脑组织中MDA含量，以柴胡皂苷d+黄芩苷作用最为明显(P<0.05)(见表1、表2)。

2.3 脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织和血清中抗氧化酶活性变化

正常对照组与假手术组小鼠血清和脑组织中CAT、SOD、GSH-PX活性差异无统计学意义；与假手术组相比，模型组血清和脑组织中CAT、SOD、GSH-PX活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比，柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组血清和脑组织中CAT、SOD、GSH-PX活性显著增强，差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明，柴胡皂苷d、黄芩苷可增强大鼠血清和脑组织中CAT、SOD、GSH-PX活性，以柴胡皂苷d+黄芩苷作用最为显著(P<0.05)(见表1、表2)。

表1 脑缺血再灌注损伤大鼠血清中抗氧化酶活性变化±s)

注：与假手术组比较**P<0.01；与模型组比较##P<0.01；与柴胡皂苷d+黄芩苷组比较△P<0.05，△△P<0.01。

表2 脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中抗氧化酶活性变化±s)

注：与假手术组比较**P<0.01；与模型组比较##P<0.01；与柴胡皂苷d+黄芩苷组比较△P<0.05，△△P<0.01。

3 讨 论

目前，对于缺血性脑血管病主要采用溶栓治疗，可重建血流，改善血供，挽救神经元。但在基础实验和临床治疗中发现，恢复血流后，细胞功能和结构破坏反而加重，即脑缺血再灌注损伤，其发病机制是一种多环节、多途径、多因素的级联反应，改善脑缺血再灌注损伤的药物包括自由基清除剂、兴奋性氨基酸拮抗剂、抗细胞间黏附分子等，但是，用药后可出现抗药性、脑出血、胃肠道反应等不良反应[7]。

氧化应激损伤，抗氧化剂不足，解毒系统失活，都影响抗氧化防御系统功能[8]。大量自由基进攻细胞，在细胞内发生过氧化反应，损伤细胞结构和功能，引起生物膜裂解，导致酶失活性以及神经元凋亡[9]。脑缺血再灌注时，产生过量自由基，而清除自由基能力未增加，进而自由基大量聚集，加重脑组织损伤[10]。机体内存在酶抗氧化系统(CAT、SOD、GSH-PX酶)和非酶抗氧化系统(维生素、硒)，在正常情况下，氧化系统与抗氧化系统处于平衡状态。脂质过氧化反应的产物主要为MDA，其含量高低可反应过氧化程度及血管损伤程度。CAT将H2O2分解成水和分子氧，阻止脂质过氧化反应，减少有机氢过氧化物损伤。SOD是一类金属酶，阻止脂质过氧化反应，可特异性清除O2-，减少O2-毒性作用。GSH-PX特异性催化还原型谷胱甘肽对H2O2的还原反应，具有保护细胞膜作用。因此，CAT、SOD、GSH-PX活力高低反应机体清除自由基的能力。

近年来，文献报道中药具有很大的潜力治疗脑缺血再灌注损伤[11]，柴胡皂苷d是柴胡根中主要成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫系统等作用。黄芩苷是黄芩的药效成分，属于黄酮类化合物。黄芩味苦，寒，具有清热燥湿功效，广泛用于肺热、黄疸等症，其药理作用包括抗氧化、抗炎、抗癌及对神经等系统的保护作用。脑缺血再灌注损伤中单独应用柴胡皂苷及黄芩苷均具有一定神经保护作用[12]，但柴胡皂苷d和黄芩苷联合应用能否减轻脑缺血再灌注损伤的相关研究较少。本研究通过建立MCAO再灌注模型，探讨柴胡皂苷d和黄芩苷联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用，结果显示，脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织和血清中CAT、SOD、GSH-PX活性明显降低，MDA含量增加，柴胡皂苷d、黄芩苷、柴胡皂苷d+黄芩苷能显著增强大鼠脑组织和血清中CAT、SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量，表明脑缺血再灌注损伤后氧化产物显著增加，清除自由基的主要活性酶活性显著下降，抗氧化能力降低；柴胡皂苷d、黄芩苷、柴胡皂苷d+黄芩苷可减少自由基的产生，减轻脂质过氧化反应，表现出良好的抗氧化损伤作用，其中柴胡皂苷d联合黄芩苷作用效果显著，研究结果证实柴胡皂苷d和黄芩苷联合应用具有减轻缺血再灌注损伤的作用，为拓宽柴胡皂苷d联合黄芩苷在脑缺血再灌注损伤中的临床应用提供了理论依据。

[1]Yan Y,Min Y,Min H,et al.n-Butanol soluble fraction of the water extract of Chinese toon fruit ameliorated focal brain ischemic insult in rats via inhibition of oxidative stress and inflammation[J].J Ethnopharmacol,2014,151(1):176-182.

[2]朱慧渊,万海同,孙理军.基于细胞能量代谢的仙鹤草不同提取物抗脑缺血再灌注损伤作用机制的实验研究[J].北京中医药大学学报,2016,39(3): 208-213.

[3]Mohamed H E,El-Swefy S E,Hasan R A,et al.Neuroprotective effect of resveratrol in diabetic cerebral ischemic-reperfused rats through regulation of inflammatory and apoptotic events[J].Diabetol Metab Syndr,2014,6(1):88.

[4]Deng R，P；M;Yang ZX,et al.Effect of electroacupuncture at conception vessel and governor vessel on correlative signals of stress-injury-repair in cerebral ischemia-reperfusion rats[J].World J Acupuncture-Moxibustion,2016,26(3):22-30.

[5]熊娟,欧阳昌汉,黄胜堂.黄芩苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].时珍国医国药,2007,9(18):2125.

[6]Silveira J P,Seito L N,Eberlin S,et al.Photoprotective and antioxidant effects of Rhubarb: Inhibitory action on tyrosinase and tyrosine kinase activities and TNF-alpha,IL-1alpha and alpha-MSH production in human melanocytes[J].BMC Complement Altern Med,2013,13:49.

[7]Chen L,Zhao Y,Zhang T,et al.Protective effect of Sheng-Nao-Kang decoction on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].J Ethnopharmacol,2014,151(1):228-236.

[8]Chao X D,Ma Y H,Luo P,et al.Up-regulation of heme oxygenase-1 attenuates brain damage after cerebral ischemia via simultaneous inhibition of superoxide production and preservation of NO bioavailability[J].Exp Neurol,2013,239:163-169.

[9]Silva J P,Gomes A C and Coutinho O P.Oxidative DNA damage protection and repair by polyphenolic compounds in PC12 cells[J].Eur J Pharmacol,2008,601(1-3):50-60.

[10]Shi G F,Wang G Y and Chen X F.Screening of radical-scavenging natural neuroprotective antioxidants fromSwertiachirayita[J].Acta Biol Hung,2013,64(3):267-278.

[11]He Y,Wan H,Du Y,et al.Protective effect of Danhong injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].J Ethnopharmacol,2012,144(2):387-394.

[12]李蓉, 李振华,谌贝贝,等.黄芩苷对全脑缺血/再灌注大鼠海马神经干细胞增殖和认知功能的影响[J].中国老年学杂志,2015,35(9):2322-2324.

[责任编辑：李蓟龙 英文编辑：刘彦哲]

Effects of Saikosaponin d Combined with Baicalin on Antioxidant Enzymes in Rat with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

CUI Yu-huan1,DONG Li-ping1,ZHAO Bao-min1,LIAN Jing-jing2, GU Wei1,YANG Ji-lei1,LIU Zhan-kuang1,WEI Yu-lei3

(1.Department of Geriatrics,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China; 2.Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou,Hebei 075000,China;3.Department of Cardiac Surgery,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Objective To study the effects and mechanism of saikosaponin d combined with baicalin on antioxidant enzymes in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Sixty SD rats were randomly divided into the control group,sham group,model group,saikosaponin d group(70 mg/kg),baicalin group(30 mg/kg),and saikosaponin d(70 mg/kg)+baicalin group (30 mg/kg).Rats were prepared with cereral ischemia-reperfusion injury by suture method.After ischemia-reperfusion,they were given drugs once daily for seven consecutive days,then neurological deficits were determined.The content of malondialdehyde(MDA)in brain tissue and serum,and the activities of catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD),and glutathione peroxidase(GSH-PX)were determined by the kits methods.Results Compared with sham group,the neurological scores significantly increased in model groups(P<0.01),and decreased in drugs groups(P<0.01).Compared with sham group,the content of MDA increased(P<0.01),the activities of CAT,SOD,GSH-PX decreased(P<0.01)in brain and serum in model group with significant difference,and saikosaponin d+baicalin reduced the content of MDA(P<0.05)and elevated the activities of CAT,SOD and GSH-PX(P<0.05)in brain and serum in saikosaponin d and baicalin group.Saikosaponin d+baicalin had better effect on antioxidant enzymes.Conclusion The protection of saikosaponin d+baicalin against cerebral ischemia-reperfusion injury might function through its anti-oxidative effect.

saikosaponin d;baicalin;cerebral ischemia-reperfusion;antioxidant enzyme

河北省卫生厅科研基金项目(No.ZL20140035)

崔玉环(1982-)，女，主治医师，主要从事脑血管病研究。

董利平(1964-)，女，主任医师，主要从事脑血管病研究。

R 285

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.02.002

来稿日期：2016-12-15