刘洋 朱宏丽 韩为东

CAR-T细胞治疗实体瘤的挑战与思考

刘洋①②朱宏丽②韩为东①

韩为东教授，医学博士，主任医师，博士研究生导师。现任解放军总医院生物治疗病区科主任，生命科学院免疫及分子生物学研究室主任，国家研究型医院生物治疗分会主任委员。从事肿瘤生物治疗研究工作20余年，致力于表观遗传学药物在肿瘤治疗方面的机制研究和临床应用的探索。在国内首创CAR-T细胞制备体系并进行相关临床研究，已获得相应专利。近5年来，先后负责并承担10余项国家级课题基金项目。作为第一作者或通信作者发表SCI论文110余篇，专利总计26项。

针对CD19靶点的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞在B细胞恶性血液系统肿瘤治疗中取得的成功，证实了抗原特异性靶向免疫细胞对肿瘤治疗的临床价值。同时这一发现也激发了CAR-T细胞技术的拓展应用性研究，多项CART细胞治疗实体瘤的临床前研究和临床研究正在开展。然而实体肿瘤和血液肿瘤本身特质上的差异决定了这种治疗模式必须重新斟酌细胞治疗本身的特点、作用规律等因素。本文讨论了CAR-T细胞治疗实体瘤相关的安全性管控措施、肿瘤靶点选择、预处理及联合治疗，并通过相关的实践经验展望该治疗方式的未来发展方向。

嵌合抗原受体T细胞 实体肿瘤 治疗模式

近年来，针对CD19靶点的嵌合抗原受体（chime⁃ric antigen receptor，CAR）T细胞在B细胞恶性血液系统肿瘤治疗中取得了突出的进步［1］。特别是在临床应用中，多项研究证实了CAR-T细胞对CD19阳性的复发难治性白血病细胞的靶向杀伤作用以及高缓解率（80%～90%）。这一事实不仅再次证实了免疫细胞治疗的临床价值，同时也激发了免疫学学者和临床医师对于其他肿瘤相关抗原和CAR-T细胞技术方面拓展应用的研究热情，多项CAR-T细胞治疗实体瘤的临床研究已在招募和研究过程中。然而在实体瘤中应用CAR-T细胞面临着诸多问题，实体肿瘤和血液肿瘤本身特质上的差异决定了这种治疗模式必须重新斟酌细胞治疗本身的特点、作用规律等因素。例如，如何将输注的CAR-T细胞从外周血中精准地“归巢”至肿瘤局部从而发挥杀伤作用仍然是一个巨大的挑战。本文归纳了多项CAR-T细胞治疗实体瘤的研究供临床参考。

1 安全性

不同于CD19仅表达于B细胞，实体瘤相关的肿瘤抗原往往不仅表达于肿瘤组织，在正常组织中亦可有低水平的表达，部分抗原甚至还有维持组织正常生理功能的作用。因此，尽管现行CAR-T细胞治疗采用了阶梯式剂量爬升的输注方式，尽可能减少不良事件（adverse event，AE）的发生，但不良反应仍然存在，其中最为突出的是脱靶效应（on-target off tu⁃mor effects）。如CAR-T细胞在清除表达相应抗原的肿瘤细胞同时，也可能攻击表达相同抗原的正常组织。本研究团队在临床实践中观察到，CAR-T细胞在非肿瘤组织中接触抗原被激活、增殖，并释放大量炎性因子而导致局部脏器的免疫损伤甚至诱发细胞因子风暴，引发严重甚至致死性AE。基于上述考虑，一种策略是提高CAR-T细胞的识别特异性，即通过技术改进使得CAR-T细胞必须同时识别两种不同抗原才能发挥免疫杀伤作用，减少攻击正常组织的可能［2］；而另一种策略与此相反，通过调整CAR-T细胞的杀伤活性（如降低CAR-T细胞与靶细胞的亲和力）从而减少对于抗原低表达正常组织的攻击。从理论上分析，虽然前者的肿瘤清除能力更强，但双靶位的特点必然导致治疗对象选择的受限；后者尽管CART细胞攻击能力降低，但拓宽了肿瘤抗原的选择谱，降低了适应证的门槛［3］。这两种实体瘤CAR-T细胞治疗策略的研究大部分处于临床试验初期，甚至临床前或基础研究阶段，究竟孰优孰劣还亟需未来临床实践的检验。

2 靶点的选择

靶点的选择是实体肿瘤CAR-T治疗的另一项挑战。B细胞血液恶性肿瘤中CD19的表达几乎达到100%，然而异质性是实体肿瘤更为突出的特点之一，这也意味着即使是同一位患者一个部位的肿瘤也并非均表达相同的肿瘤相关性抗原。即使在一个肿瘤病灶上，无一种靶抗原可以覆盖全部的肿瘤细胞。因此，如果只用一种单靶点的CAR-T细胞治疗实体肿瘤，那么理论上实体瘤高度异质性的特点就决定了其必然会复发或无法根除。检索CAR-T治疗实体瘤临床文献，可以发现大部分CAR-T临床研究的有效率较低（≤20%），疗效维持时间较短。本研究团队前期以表皮生长因子受体（epidermal growth factor re⁃ceptor，EGFR）为靶点的CAR-T临床研究数据显示：在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的病例中，即使病理结果证实EGFR阳性的肿瘤细胞已被大量清除，10例患者中仅2例达到部分缓解（par⁃tial remission，PR），疗效维持时间分别为2个月和10个月［4］。该研究数据提示，单一靶点的CAR-T细胞治疗可能难以给实体肿瘤带来更高的有效率和更长的无进展生存时间（progression free survival，PFS）。如果CAR-T同时针对2种靶抗原呢？从本研究团队未发表的胰腺癌病例免疫组织化学结果推测，接近50%的上皮源性肿瘤可能适合EGFR1和HER-2组合的CAR-T治疗体系。

肿瘤初始细胞（或称肿瘤干细胞）是肿瘤治疗中不可忽视的重要因素，它参与肿瘤的发生、转移、进展以及耐药［5］。现有理论推测，肿瘤病灶中大部分细胞是由少量肿瘤干样细胞分化增殖而来，有效清除肿瘤干细胞将使治愈肿瘤成为可能。肿瘤干细胞生物学行为及其背后分子生物学和信号通路是当下肿瘤基础研究的热点之一［6］。但遗憾的是，现有关于清除肿瘤干细胞的临床研究均未得到理想的结果，甚至无病例缓解的报道。然而，基础研究结果提示免疫细胞可以清除处于休眠状态且化疗耐药的肿瘤干细胞，提示调整合适的靶抗原CAR-T或许可以从“源头”治疗肿瘤［7］。为分离、获得纯度更高的肿瘤干细胞，研究通常选择细胞表面分子CD44、CD133、ABCG2作为标记物进行筛选，这些细胞表面分子亦可作为CAR-T细胞的靶抗原［6］。本研究团队发现，CD133是一个极具潜力的CAR-T细胞靶抗原，它不仅可以用于分离上皮源性肿瘤的肿瘤干细胞，同时也是循环中内皮祖细胞的细胞表面标记，同时后者更被认为是肿瘤远处转移前微环境的必需细胞类型［8］。因此，CAR-T-CD133具有潜在“双靶”的特点，本研究团队已于2016年注册了以CD133为靶点的CART细胞临床研究（NCT02541370）。

多种CAR-T细胞多靶点的组合治疗应以何种方式进行？是应该多种CAR-T一次性混合输注治疗，还是不同CAR-T细胞依次“序贯性”治疗。目前的认识和实践经验提示，CAR-T细胞输注后体内同样可以产生抗体，抑制其靶向杀伤作用，如选择鼠源的抗体序列构建CAR分子，可以从回输受试者体内检测到相应人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HA⁃MA）。这可能意味着，混合性输注CAR-T不仅加大了治疗的风险，而且一次性混合输注可能产生多重靶点的CAR细胞耐药。因此，针对多种CAR-T联合治疗的模式，本研究团队更倾向于不同细胞依次回输，而不是同时回输。

3 CAR-T细胞的体内归巢与活化维持

将细胞归巢至肿瘤局部并且活化增殖是CAR-T细胞治疗起效的关键步骤。只有从外周血迁移至肿瘤部位的CAR-T细胞才有机会杀伤肿瘤。因此，有学者正在通过动物模型研究试图改变CAR-T本身的一些特性来增强细胞迁移至肿瘤的能力和效率［9］。CAR-T修饰性研究需要谨慎地开展大量安全性评估，因此该项研究目前仍徘徊于临床前阶段。在临床实践中，则往往通过已有药物或临床已获批的方法，如放化疗、免疫检查点抑制剂或激活剂、小分子靶向药物等来尝试解决CAR-T细胞进入肿瘤病灶的问题。

部分化疗药物不仅是细胞毒性药物，同时也是免疫佐剂。合适的化疗药物配伍可以增强肿瘤细胞的免疫原性，减少肿瘤免疫抑制因素，激发和增强免疫反应，从而提高CAR-T细胞本身的抗瘤活性［10］。如白蛋白紫杉醇为目前公认的可以减少肿瘤间质的药物，通过减少间质成分可能帮助CAR-T细胞浸润至肿瘤病灶内部；再如环磷酰胺可以有效地清除肿瘤内源性的淋巴细胞和体内免疫抑制性细胞，从而有利于CAR-T细胞的体内扩增和疗效维持。本研究团队目前开展的临床研究（CAR-T-EGFR NCT01869166，CAR-T-HER2 NCT 01935843，CAR-T-CD133 NCT02541370，CAR-T-Mesot helin NCT02580747）中。实体肿瘤预处理通常采用白蛋白结合型紫杉醇+环玲酰胺的联合方案；血液肿瘤多以福达拉滨+环玲酰胺为基础的预处理方案。另外，福达拉滨和环磷酰胺常被用于血液肿瘤的CAR-T细胞预处理。

局部放疗可以引发全身抗肿瘤免疫反应的增强。研究发现，局部放疗可以增加肿瘤内的淋巴细胞数量，少数病例甚至会出现未照射病灶的缩小，即远端效应［10］。不同研究显示，局部放疗可以增加肿瘤抗原的释放和表达，增强肿瘤局部的免疫细胞趋化效应，同时提高DC细胞活性等，从而触发和加强“免疫环”的诸多环节［11］。如果将CAR-T细胞与局部放疗相结合是否会在抗肿瘤机制上产生互补效应？放疗能否提高和改善细胞治疗的疗效？上述问题均有待于进一步研究和探讨。

4“强化CAR-T”策略的选择

通过修饰CAR-T细胞本身来“升级”其抗瘤活性也成为提高疗效的策略之一［9］。基因修饰技术可以使CAR-T细胞在被激活的同时表达和释放IL-12以及溶瘤病毒。另外一项策略，可从富含肿瘤新抗原特异性的T细胞（tumor neoantigen-specific TCR T cell）中进行CAR-T细胞培养。研究显示，低剂量地西他滨可以显著拓展外周血T细胞的TCR库［12］。因此，从表观药物治疗后的患者中采血或许可以培养出更为“强大”的CAR-T细胞。

5 展望

尽管困难重重，但是实体瘤的CAR-T细胞治疗仍然是值得期待的。修饰CAR-T细胞本身或CAR-T细胞与现有治疗的联合这两种研究方向均为提高CART细胞治疗实体瘤的疗效带来希望。实体瘤细胞本身异质性、等级性、抗原迁移以及微环境免疫抑制等特点，以及对CAR-T细胞自身特性的认知进一步深入，促使本研究团队对CAR-T细胞在实体瘤治疗中的应用产生新的认识和大胆的假设，即新辅助预处理下的多靶点CAR-T细胞的鸡尾酒联合治疗模式。本研究团队相信，在未来运用CAR-T细胞对肿瘤进行精确、多靶点更替式的打击可能会改变晚期肿瘤的治疗和管理模式：即从最佳支持走向积极治愈。

[1]ZhangT,CaoL,XieJ,etal.EfficiencyofCD19chimericantigenreceptormodified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials:a meta-analysis[J].Oncotarget,2015,6(32):33961-33971.

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[7] Abate-Daga D,Lagisetty KH,Tran E,et al.A novel chimeric antigen receptor against prostate stem cell antigen mediates tumor destruction in a humanized mouse model of pancreatic cancer[J].Hum Gene Ther,2014,25(12):1003-1012.

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[12]Nie J,Zhang Y,Li X,et al.DNA demethylating agent decitabine broadens the peripheral T cell receptor repertoire[J].Oncotarget,2016,7(25): 37882-37892.

（2017-02-23收稿）（2017-04-05修回）

（编辑：孙喜佳 校对：郑莉）

刘洋 专业方向为肿瘤免疫治疗。

Chimeric antigen receptor T cell based therapeutic modality in solid tumors

Yang LIU1,2,Hongli ZHU2,Weidong HAN1

Weidong HAN;E-mail:hanwdrsw69@yahoo.com
1Department of Molecular and Immunology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China;2Department of Geriatric Hematology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

The CD19-targeted chimeric antigen receptor(CAR)T-cell treatment has achieved clinical success in treating B-cell lineage hematopoietic malignancies.This accomplishment involved the precise and efficient elimination of tumor cells by tumor-associated antigen-redirected immune cells.As a result,the reinitiation of several CAR T-cell(CART)based clinical trials in solid tumors was promoted.However,developing a feasible and efficient CAR T based therapeutic modality for solid tumors is urgently needed given the differential properties between liquid and solid tumors.In this review,we discuss the advances in the management of cytotherapeutic modality for solid tumors.The aspects considered include toxicity management,target selection,and primer or conditioning treatment.

chimeric antigen receptor T cell,solid tumors,therapeutic modality

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.09.201

E-mail：liuyang301blood@163.com

①解放军总医院生命科学院生物治疗病区（北京市100853）；②老年血液科

韩为东 hanwdrsw69@yahoo.com