邹琴 谢能君 喻世刚 廖娟 王钢

（乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000）

人工养殖王锦蛇粪源大肠杆菌耐药性检测分析*

邹琴 谢能君 喻世刚 廖娟 王钢**

（乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000）

采取人工养殖王锦蛇的粪便，进行大肠杆菌的分离鉴定，将分离的杆菌接种在琼脂平板后，按照CLSI推荐的K—B药敏纸片法进行18种抗生素的耐药性检测，其结果表明：头孢唑啉、氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氯霉素、卡那霉素、恩诺沙星、利福平、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、链霉素是低度敏感；头孢哌酮、妥布霉素、头孢噻肟中度敏感；诺氟沙星耐药。

人工养殖王锦蛇；大肠杆菌；抗生素；耐药性

大肠杆菌（Escherichia coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌，人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。同时大肠杆菌也是耐药基因的重要传播介体[1]。王锦蛇（Elaphe carinata）属脊索动物门，脊椎动物亚门，爬行纲，有鳞目，蛇亚目，游蛇科，锦蛇属的动物[2]，广泛分布于我国南方各省。王锦蛇属无毒蛇，已被列入国家林业局2000年8月1日发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》。多年来因被大量捕杀和对其栖息环境的破坏，野外种群数量呈不断下降之势[3]，因此，大力开展王锦蛇的人工养殖是必经之路，而抗生素在人工蛇养殖过程中已成为不可或缺的手段，但是长期大量使用抗生素造成的药物残留、耐药菌株出现等问题愈演愈烈，造成耐药细菌的种类不断增加，甚至导致多重耐药性。本研究对人工养殖蛇粪源中大肠杆菌的耐药性进行研究，为今后进一步研究和追踪人工养殖王锦蛇大肠杆菌耐药性的变化奠定基础，也对人工养殖王锦蛇疫病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 培养基

营养琼脂粉、麦康凯琼脂均购自于杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 抗生素

18 种抗菌药药敏纸片：头孢唑啉、氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氯霉素、卡那霉素、恩诺沙星、利福平、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、链霉素、头孢哌酮、妥布霉素、头孢赛肟、诺氟沙星，上述材料均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 样品来源

1月5 号中午采集人工常规养殖的1龄王锦蛇粪便。

1.4 大肠杆菌的分离纯化和鉴定

称取粪源样品5 g，加入1 mL无菌水，摇匀，震荡，并吸取100 μ mL涂布平板，37℃培养24 h，随时观察菌落的生长情况。待麦康凯琼脂平板上形成粉红色菌落后，挑取典型的单个菌落进行革兰氏染色并镜检，初步对分离菌进行鉴定，将符合大肠杆菌特点的菌落接种于营养琼脂平板上，于37℃培养24 h后4℃冰箱保存备用；采用肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管进一步鉴定。

1.5 药敏测试

将锥形瓶、培养皿、枪头、试管、生理盐水置于高压灭菌锅中灭菌；称8.4g营养琼脂粉溶于200mL蒸馏水中，锥形瓶定容；在试管中取用生理盐水稀释后的大肠杆菌液1 mL接种于培养基，涂布均匀，并贴上抗菌药药敏纸片，放入恒温培养箱中培养24 h；测抑菌圈直径，测3次，取平均值，得出每种抗生素耐药性结果。

判断标准[4]：抑菌圈直径为≥20 mm为高敏；抑菌圈直径在15～20 mm之间为中敏；抑菌圈直径≤15 mm为低敏；无抑菌圈为耐药。

2 结果

由不同抗生素抑菌圈平均直径与耐药性（表1）可知：头孢唑啉、氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氯霉素、卡那霉素、恩诺沙星、利福平、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、链霉素是低敏；头孢哌酮、妥布霉素、头孢赛肟是中敏；诺氟沙星是耐药。

表1 不同抗生素抑菌圈平均直径与耐药性

3 讨论

大部分抗生素对人工养殖蛇已经是低敏，这是否与长期使用抗生素有关，还有待进一步研究。但此结果为进一步研究人工养殖蛇肠道抗生素耐药性奠定了基础。因此，在选择药物时，最好选择几种比较敏感的药物联合或交替使用，减少单一药物的使用剂量或使用时间，从而减少肠道菌群耐药性的产生，也可通过推广健康养殖、生态养殖，严格控制抗生素的使用，延缓或控制耐药菌的出现。

［1］杨宇宸，崔泽林，郭晓奎，等.常见养殖淡水鱼肠道细菌耐药性研究［J］.国医生物制品学，2011，34(1):1673-4211.

［2］湖南省人民政府.湖南省地方重点保护野生动物名录［R］.2002-09-05．

［3］陶吉兴，刘安兴，杨友金,等.浙江重点蛇类资源数量与生态分布研究［J］.浙江大学学报：农业与生命科学版，2003，29(5)：563-568．

［4］王俊丽，张要齐，孙雪峰.18种中药对猪大肠杆菌的体外抑菌活性的测定方法比较［J］.安徽农业科学，2012，40 (26)：12 947-12 948．

第1作者简介：邹琴（1995-），女，本科在读，动植物检验检疫专业。

Resistance Testing Analysis of Fecal E.coli of Artificial Culturing Elaphe carinata

ZOUQin
（Leshan Normal University,SichuanLeshan157009）

Method The stool samples of artificial culturing Elaphe carinata were collected for isolation and identification of E.coli applying pathogenic assay method.Antimicrobial susceptivity test were conducted by using the Kirby-Bauer method recommended by CLSI to examine the sensitivity against 18 antibiotics.It needs label paper of antibiotics to nutrient medium,culture for 24 hours,and measure the diameter of bacteriostaticcircle.TheresultsShowedthatCefazolin,ofloxacin,ceftriaxoneandqingdatoxin, ciprofloxacin,andamikacin,chloramphenicol,kanamycin,andenrofloxacin,rifampicin,florfenicoland doxycycline,Co-trimoxazole and streptomycin is less sensitive;Cefoperazone,tobramycin,cephalosporins oxime is moderately sensitive;Norfloxacin is resistance.

Artificial culturing Elaphe carinata;E.coli;Antibiotics;Antibiotic resistance

Q939.121,Q959.3

A

王钢（1979-），男，副教授，硕士，主要从事动物疫病检测与防控、养殖业废弃物处理与资源化利用。

2017-03-03

（责任编辑：李丹）

*乐山师范学院校地合作项目（Z1530）

1001-9499（2017）03-0013-02