宋 伦， 吴 景， 宋永刚， 刘卫东， 杨国军

1．辽宁省海洋水产科学研究院， 辽宁省海洋生物资源与生态学重点实验室， 辽宁 大连 116023 2．大连海洋大学， 辽宁 大连 116023

褐潮致灾种抑食金球藻在辽东湾的分布

宋 伦1， 吴 景1， 宋永刚1， 刘卫东1， 杨国军2

1．辽宁省海洋水产科学研究院， 辽宁省海洋生物资源与生态学重点实验室， 辽宁 大连 116023 2．大连海洋大学， 辽宁 大连 116023

抑食金球藻可产生一种抑制双壳类动物摄食的胞外多糖，导致贝类大量死亡．由于抑食金球藻个体微小、形态学鉴定困难，故在辽东湾海域鲜见其分布报道，而高通量测序技术的发展极大地推动了微型微微型浮游植物的鉴定研究．以18S rDNA V4区作为目标基因，结合高通量测序技术，设计了微型微微型浮游植物鉴定引物V4(FR)，并对辽东湾2014年四季海水中微型和微微型浮游植物多样性进行了检测．结果表明，辽东湾抑食金球藻春季密度(7．743×103L-1)最高，夏季(2．094×103L-1)、秋季(0．392×103L-1)、冬季(0．053×103L-1)密度逐渐下降，水温是影响该藻暴发的主要因素，也验证了渤海褐潮多暴发在春季的原因．抑食金球藻密度高值区主要分布在与河北秦皇岛交界的绥中海域，该地区与实际暴发褐潮海域相邻，验证了检测结果的可靠性．春季抑食金球藻在西南海域优势度(平均40%)最高，其密度最高达78．128×103L-1，虽未达到警戒标准，但分布扩散较广，致灾风险较高，应引起足够的重视．

抑食金球藻； 褐潮； 微微型浮游植物； 高通量测序； 辽东湾

褐潮作为我国新型海洋生态灾害，2009年起开始入侵渤海，我国也是继美国和南非之后，第三个暴发褐潮的国家，其中河北秦皇岛海域贝类养殖受灾最为严重[1- 2]．渤海褐潮致灾种主要为抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)，属棕鞭藻门(原归类金藻门)、海金藻纲，球形或椭球形、金褐色、无细胞壁、单个叶绿体、细胞无鞭毛、不能运动且生命周期简单[3]．由于其个体微小(2～3 μm)，依据形态学等常规鉴定较为困难．随着分子生物学的快速发展，微型藻类的分子检测手段也在不断进步和完善[4- 9]，相关的基因文库也在逐步更新和扩充．近几年高通量测序技术的发展极大地推动了微型藻类的高效检测研究[10- 11]，该技术具有简单快速、测序通量高、错误率低和成本低等特点，为微型藻类的高效检测提供了新思路[12]．核糖体小亚基基因18S rDNA存在于所有真核生物中，是同时具有信息和功能两种作用的核糖体编码基因[13]，其数据库丰富、基因序列种类广泛，对引物设计、构建物种亲缘关系等方面都具有不可替代的优势．18S rDNA由保守区和可变区交替排列组成，具有9个可变区[14]，可作为种属鉴定的分子标记．V4区和V9区是目前广泛应用于真核生物多样性研究的目标基因[8，15- 16]．

抑食金球藻褐潮1985年首次发生在美国东北部的纳拉干塞特湾、大南湾、长岛湾以及巴尼加特湾，此后一直到1995年，几乎每年长岛湾都有褐潮发生，2000年后，褐潮沿着美国东海岸向南扩张到新泽西州、特拉华州、马里兰州以及弗吉尼亚州的海湾．除此之外，1997年南非的萨尔达尼亚湾也开始暴发了褐潮，文献记录持续到2005年[17]．我国在2009年渤海暴发褐潮之前鲜有该种的报道[18]，该种褐潮一直持续到2015年，最大面积达3 400 km2，分布于辽东湾西南侧的河北和辽宁交界海域，褐潮期间养殖贝类滞长、部分死亡，生态系统遭到破坏，旅游业、水产养殖业经济损失巨大[12]．辽东湾为我国最北端半封闭内海，航运较为频繁，加之富营养化严重，发生外来有害微藻入侵的风险较高，危害较大，目前该海域已发现外来有害微藻抑食金球藻的扩散迹象，因此亟需了解其生态分布状况．鉴于此该研究采用高通量测序平台，结合生物信息学方法，以18S rDNA的V4区为目标基因对辽东湾海域的微型和微微型浮游植物进行多样性检测，以期为外来海洋微藻研究提供参考．

1 材料与方法

1．1 样品采集

为了解褐潮致灾种抑食金球藻的分布及扩散情况，在辽东湾海域网格化设置16个站位(见图1)，分别于2014年5月(春季)、8月(夏季)、10月(秋季)、12月(冬季)采集表层海水1 L，首先经20 μm微孔滤膜过滤去除小型及大型浮游生物，然后经0．22 μm微孔滤膜收集微型和微微型浮游生物，最后将滤膜转移至1．5 mL无菌离心管中，置于-20 ℃或-80 ℃冷冻保存、运输．

图1 采样站位分布Fig．1 Sampling station locations

1．2 分析方法

1．2．1 基因组 DNA 的提取

1．2．2 18S rDNA可变区V4的PCR扩增

1．2．3 引物筛选优化

于NCBI数据库中调取相关序列，其中包括微微型真核藻类45种、我国近岸赤潮生物71种及常见真核藻类73种，涵盖8个门、18个纲、179条序列．利用MEGA 4软件对序列进行多重序列比对，找到对应的V4区，同时结合Hiseq 2500 PE250测序技术要求进行引物设计，片段长度为300～450 bp，为增加测序结果的准确性，充分利用测序技术，以V4区为核心区及两侧的保守区设计引物，获得两对引物V4(FR)，使用FPCR软件检测引物的熔解温度、GC含量，以及是否会产生二聚体，利用Oligo Calc软件检测引物自身的互补性，包括潜在的发夹结构、3′端的互补性、自身退火位点个数等基本参数．根据核糖体基因数据库采用在线软件Taxman，以多来源的rDNA为模板，通过多序列全局比对，对引物扩增的生物类群和未扩增的生物类群物种数量进行预测统计、比较，进而对3对引物的敏感性、特异性进行评估[19]．

1．2．4 数据分析

测序得到的原始数据使用FLASH软件进行拼接，参照Qiime软件质量控制流程将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据．利用Uparse软件对有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类，采用RDP Classifier方法与Silva数据库对OTUs代表序列进行物种注释，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析．镜检同期水样中出现的所有浮游植物，筛选各站位出现频度最高的角毛藻(Chaetocerossp．)作为基准种类[20]，通过OTUs比例计算抑食金球藻密度，相关公式：

式中：NS为某站位抑食金球藻密度，L-1；NC为同一站位水样中所有角毛藻密度，由镜检获得，L-1；COTU为某站位水样中所有角毛藻的OTUs数；SOTU为某站位抑食金球藻的OTUs数．

采用相对多度(RA)计算抑食金球藻密度在各季节的比例：

RA=niN

式中：ni为抑食金球藻在i站的密度，L-1；N为统计单元的总密度，L-1．

物种优势度(Y)表示微型微微型浮游植物群落中某一物种所占的优势程度：

式中，nx为第x种微型微微型浮游植物种类的OTUs数，N为OTUs总数，fx为第x种微型微微型浮游植物种类在各样品中出现的频率．

2 结果与讨论

2．1 分子鉴定引物优化

采用在线软件Taxman对3对引物的敏感性、特异性进行评估，统计数据(见表1)显示，引物V9(FR)的整体扩增效率低于引物V4(FR)和C4(FR)，引物V4(FR)对真菌、后生动物、领鞭毛虫目类群的扩增特异性低于C4(FR)，对定鞭藻纲、绿藻门等生物类群的扩增特异性高于C4(FR)，说明V4(FR)在扩增真核藻类类群中较有优势．

为了比较3对引物在实际样品中对真核藻类扩增特异性的差异，对2014年5—8月采集的8、11、12号站位环境样品分别进行引物扩增，采用Illumina Hiseq 2500测序平台PE250测序，解析出在种的水平下每对引物对应的平均微型微微型浮游植物OTUs数．结果显示，3对引物在8、11、12号站位鉴定的微型微微型浮游植物OTUs数按序分别为：V4(68、73、92)、V9(37、46、44)、C4(33、59、81)，平均为78、42、58，引物V4(FR)鉴定出的浮游植物数量多于V9(FR)和C4(FR)．通过3对引物对优势种Dolichomastixtenuilepis、细小微胞藻(Micromonaspusilla)、金牛微球藻(Ostreococcustauri)、密球藻(Pycnococcusprovasolii)、抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)、赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)等微型和微微型浮游植物的鉴定能力比较，显示引物V4(FR)与C4(FR)相近，二者的鉴定效率强于V9(FR)．综上，引物V4(FR)在微型微微型浮游植物种类数鉴定方面优于其他两对引物，故采用引物V4(FR)研究辽东湾海域微型微微型浮游植物的群落多样性．

表1 引物对扩增SILVA数据库中真核生物类群的特异性统计

注：引物对主要扩增真核类群的频数分布，括号内的数字表示扩增该类群的序列数，括号外的数字表示扩增序列数占该类群序列数的比例．

2．2 抑食金球藻的种属确定

高通量测序获得抑食金球藻部分18S rDNA序列的片段长度为380 bp，通过NCBI Blast比对，其在抑食金球藻18S rDNA(KT585674．1)基因序列中对应的位置为563～942 bp，与基因库中抑食金球藻的部分18S rDNA序列相似度为100%，拟合度期望值(E-value)为0．采用邻接法选择棕鞭藻门中部分藻类的18S rDNA序列构建系统进化树(见图2)．建树结果显示，高通量测序获得的辽东湾抑食金球藻18S rDNA V4区序列与基因库中抑食金球藻(KT585674．1)聚在一个分支，其支持率为100%，确定该种为抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)．

注： 节点上的数值表示邻接法的可靠性.图2 抑食金球藻系统进化树Fig．2 Aureococcus anophagefferens phylogenetic tree

2．3 藻密度平面分布

辽东湾春季检出抑食金球藻密度最高，分布在0．001×103～78．128×103L-1之间，平均值为7．743×103L-1，最高值出现在10号站位，最低值出现在4号站位，高值区主要分布在辽东湾的西南、中部、东南海域(3、5、6、8、10、11、13、14、15、16号站位密度均超过103L-1，其中10、11、16号站位密度均超过104L-1)，辽东湾西北部海域密度相对较小；夏季密度分布在0．000 2×103～15．609×103L-1之间，平均值为2．094×103L-1，最高值出现在16号站位，最低值出现在9号站位，高值区主要分布在辽东湾的东南、西南两侧海域(10、16号站位密度均超过104L-1)，辽东湾北部海域密度相对较小；秋季密度分布在0．001×103～2．293×103L-1之间，平均值为0．392×103L-1，最高值出现在9号站位，最低值出现在1号站位，高值区主要分布在辽东湾的西南、中东两侧海域(9、10号站位密度均超过2×103L-1)，其他区域密度相对较小；冬季密度分布在0．000 1×103～0．345×103L-1之间，平均值为0．053×103L-1，最高值出现在4号站位，最低值出现在6号站位，高值区主要分布在辽东湾的中南部海域，冬季密度相对较小，各站位差异不大，分布较为均匀．各站位抑食金球藻密度占比的季节分布见图3．

2．4 相对密度季节变化

统计各站位抑食金球藻季节相对密度(见图4)发现，春季占比最高(平均61．4%)，夏季次之(平均19．3%)，依次为秋季(平均13．1%)，冬季最少(平均6．2%)．说明春季为抑食金球藻主要繁殖季节，水温为主要控制因素．

注： 图中等值线表示抑食金球藻密度占比， %．图3 抑食金球藻密度占比的季节分布Fig．3 The horizontal distribution of Aureococcus anophagefferens density ratio in different seasons

图4 抑食金球藻季节相对密度分布Fig．4 Relative density of Aureococcus anophagefferens in different seasons

2．5 优势度

春季抑食金球藻优势度在0．004%～62．70%之间，平均值为7．92%，主要在辽东湾西南部占优势，各站位间极差较大，优势度最高值出现在11号站位，其次为10号站位(33．20%)、14号站位(25．20%)，上述3个站位抑食金球藻优势度非常明显，除4号站位外，其余站位优势度均超过0．2%，其中5、9、10、11、14号站位优势度均超过1%；夏季抑食金球藻优势度在0．003%～0．96%之间，平均值为0．26%，主要在辽东湾中南部占优势，各站位优势度不明显，优势度最高值出现在14号站位，最低为4号站位，其中10、11、12、14、15、16号站位优势度均超过0．2%，所有站位优势度均未超过1%；秋季抑食金球藻优势度在0．002%～1．98%之间，平均值为0．55%，主要在辽东湾中西、中东、东南部海域占优势，各站位优势度不明显，优势度最高值出现在9号站位，最低为4号站位，其中7、9、10、11、12、14、15、16号站位优势度均超过0．2%，7、9、12、15号站位优势度均超过1%；冬季抑食金球藻优势度在0．008%～1．05%之间，平均值为0．28%，主要在辽东湾中东、中南部占优势，各站位间极差较大，优势度最高值出现在11号站位，最低为1号站位，其中8、9、11、12、14、15号站位优势度均超过0．2%，仅11号站位优势度超过1%(见图5、6)．

图5 抑食金球藻优势度季节分布Fig．5 Aureococcus anophagefferens dominance in different seasons

2.6 讨论

在选定18S rDNA为鉴定真核藻类目标基因后，为了验证V4区和V9区对海水环境样本中微量真核藻类的高效检测能力，自行设计了引物V4(FR)，并选择引物C4(FR)和V9(FR)作为分析比较对象．3对引物的敏感性、特异性评估结果显示，V4(FR)对真核藻类的扩增特异性优于C4(FR)，尤其对甲藻、硅藻、绿藻、隐藻、定鞭藻等类群的扩增效率更为高效．18S rDNA的V4区变异较大、长度较长、均一性好，适用于高通量测序技术，是真核藻类鉴定的良好目标基因．随着高通量测序技术的发展，测序通量不断增大，测序片段长度也可逐渐增长，物种注释的准确度也会逐渐提升．18S rDNA V4区片段长度高于V9区，并且其测序结果更接近18S rDNA的全长序列[21]，因此利用18S rDNA V4区作为目标基因，通过宏基因组的高通量测序技术来鉴定真核藻类更为准确和高效．引物筛选结果显示，该研究自行设计的引物—V4(FR)在微型微微型浮游植物群落鉴定方面更为高效．

注： 图中等值线表示抑食金球藻优势度， %．图6 抑食金球藻优势度季节平面分布Fig．6 Aureococcus anophagefferens dominance horizontal distribution in different seasons

关于抑食金球藻的研究国外开展较早，国内自从褐潮暴发后才逐渐受到关注，目前已对其生理生化特征、暴发与消亡原因、生态危害及预防措施等方面开展了大量研究[12，17]．抑食金球藻可产生一种抑制双壳类动物摄食的胞外多糖，通过刺激贝类鳃部肌肉收缩、干涉横沟和腹沟的纤毛运动来阻止其摄食．研究[22- 23]证实，抑食金球藻可使硬壳蛤(Mercenariamercenaria)、海湾扇贝(Argopectenirradias)、紫贻贝(Mytilusedulis)、文蛤(Meretrixmeretrix)、牡蛎(ConchaOstreae)等纤毛活动受到抑制，进而停止摄食、减缓生长、影响繁殖，最终大量死亡．

抑食金球藻环境适应能力较强，可在较广的水温范围内(0～25 ℃)发生褐潮，最适生长温度为20 ℃左右，渤海褐潮主要发生在温度达到15～20 ℃的5—6月，超过25 ℃的7—8月开始衰退，然而温度降至20 ℃的秋季也有可能发生褐潮，并持续到寒冷的冬季(0 ℃)[24]．抑食金球藻适盐范围(10～90)也非常宽泛，在25 ℃下最适生长盐度为20～70，因此辽东湾任何海域都有可能暴发褐潮．抑食金球藻能够适应低光照环境，可能其较小的叶绿体基因组完成光合作用更为高效．抑食金球藻不仅可利用无机营养盐，还可有效地利用有机营养物质，因其含有更多与有机碳、有机氮化合物运输的相关基因，这也解释了大粒径赤潮生物衰败分解后随即暴发褐潮的原因[25]．

通过对辽东湾四季抑食金球藻的检测发现，春季密度最高，夏、秋、冬季密度逐渐下降，说明温度是影响该藻繁殖的主要因素，也验证了渤海褐潮多暴发在春季的原因．抑食金球藻密度高值区主要分布在与河北秦皇岛交界的绥中海域，与实际暴发褐潮海域相邻，验证了检测结果的可靠性．春季抑食金球藻在西南海域优势度非常高(平均40%)，其密度最高达78．128×103L-1，虽未达到警戒标准，但分布扩散较广，致灾风险较高，应引起足够重视．

抑食金球藻在我国海域近几年才被报道，应列为外来有害微藻进行监控管理．从目前辽东湾海域的抑食金球藻密度分布来看，该种已成为归化种，2013年7月在长兴岛近岸海域曾发生小范围抑食金球藻褐潮，密度超过107L-1[26]．因此应尽快开展该藻的风险监测，研究防控措施；跟踪监测各港口海域有毒微型微微型藻类的种群和分布；加强对养殖区产毒微藻的监测和管理，建立贝毒快速预警技术，减少对渔业生态系统的危害[27- 30]．

3 结论

a) 辽东湾抑食金球藻春季密度最高，平均值为7．743×103L-1，高值区主要分布在辽东湾的西南、中部、东南海域；夏季密度平均值为2．094×103L-1，高值区主要分布在辽东湾的东南、西南两侧海域；秋季密度平均值为0．392×103L-1，高值区主要分布在辽东湾的西南、中东两侧海域；冬季密度平均值为0．053×103L-1，高值区主要分布在辽东湾的中南部海域．

b) 抑食金球藻相对密度春季最高(平均61．4%)，夏季次之(平均19．3%)，依次为秋季(平均13．1%)，冬季最少(平均6．2%)．说明春季为抑食金球藻主要繁殖季节，水温为主要控制因素．

c) 抑食金球藻春季优势度平均值为7．92%，主要在辽东湾西南部占优势；夏季优势度平均值为0．26%，主要在辽东湾中南部占优势；秋季优势度平均值为0．55%，主要在辽东湾中西、中东、东南部海域占优势；冬季优势度平均值为0．28%，主要在辽东湾中东、中南部占优势．

d) 抑食金球藻虽然在我国海域近几年才被发现，但其环境适应能力较强，已在辽东湾海域广泛分布，随时都有大面积暴发的可能，因此应加强有效监控，研究应急处置措施，减少渔业及生态损害．

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Distribution of Brown Tide SpeciesAureococcusanophagefferensin Liaodong Bay

SONG Lun1， WU Jing1， SONG Yonggang1， LIU Weidong1， YANG Guojun2

1．Key Laboratory of Marine Biological Resources and Ecology， Liaoning Province， Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute， Dalian 116023， China 2．Dalian Ocean University， Dalian 116023， China

Aureococcusanophagefferens(Ochrophyta，Pelagophyceae)inhibits bivalve feeding by producing a type of extracellular polysaccharide，and results in high shellfish mortality．Morphological identification ofA．anophagefferensis difficult because of its small size，which has delayed research progress．In recent years，the development of high-throughput sequencing technologies has promoted research on nanophytoplankton and picophytoplankton．To identifyA．anophagefferensand determine its distribution in Liaodong Bay，we used the 18S rDNA V4 region as the target gene to design the primer V4(FR)，and employed high-throughput sequencing technique to study nanophytoplankton and picophytoplankton diversity in Liaodong Bay．The results revealed thatA．anophagefferensdensity was highest in the spring(7．743 × 103L-1)．Temperature was a significant factor inA．anophagefferensreproduction．A．anophagefferensdensity was high in Suizhong waters；this area is adjacent to Hebei Qinhuangdao，where the phytoplankton has caused brown tide outbreaks．The previous outbreak history supports our current results．A．anophagefferenscommunity dominance was high in the southwest，averaging 40%，and its density was as great as 78．128 × 103L-1．In recent years，A．anophagefferenswas found in the China Sea，where it has caused severe ecological impacts．According to our results，A．anophagefferenscould be classified as a newly naturalized species based on its distribution in Liaodong Bay．The phytoplankton was responsible for a small-scale brown tide(>1．0 × 107L-1)in Changxingdao in July 2013．We recommend that measures be taken to preventA．anophagefferensbrown tides rather than acting after the fact．First，we should monitor the types and distribution of toxic nanopicophytoplankton in port waters to supplement the invasive algae database．Second，we should enhance toxic microalgae monitoring and management in aquiculture areas．Finally，a brown tide early warning system should be established to avoid disasters in the fishery ecosystem．

Aureococcusanophagefferens； brown tide； picophytoplankton； high-throughput sequencing； Liaodong Bay

2016- 08- 19

2016- 12- 27

中国海洋发展研究会重大项目(CAMAZDA201605)；辽宁省自然科学基金资助项目(2014020182)；辽宁省海洋与渔业科研项目(201611)

宋伦(1980-)，男，辽宁大连人，副研究员，主要从事海洋生物生态学研究，songlun@lnshky．com．

X171．1； Q89； P735

1001- 6929(2017)04- 0537- 08

A

10．13198j．issn．1001- 6929．2017．01．87

宋伦，吴景，宋永刚，等．褐潮致灾种抑食金球藻在辽东湾的分布[J]．环境科学研究，2017，30(4)：537-544.

SONG Lun，WU Jing，SONG Yonggang，etal．Distribution of brown tide speciesAureococcusanophagefferensin Liaodong Bay[J]．Research of Environmental Sciences，2017，30(4)：537-544.