王晓茜，鲍文华，钟 铨，马雪梅，文 锐，孙云晖

(佳木斯大学附属第一医院呼吸内科，黑龙江 佳木斯 154003)

松弛素在大鼠放射性肺损伤中的表达及作用①

王晓茜，鲍文华，钟 铨，马雪梅，文 锐，孙云晖

(佳木斯大学附属第一医院呼吸内科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨松弛素在不同剂量大鼠放射性肺损伤模型中的表达和作用。方法：分别建立高、中、低三个剂量的放射性肺损伤动物模型，运用荧光定量-PCR法测定照射后1天、7、天、14天、28天肺组织中松弛素mRNA的表达量，行H-E染色后观察镜下肺组织病理改变。结果：高剂量组肺组织松弛素mRNA表达量最多，中剂量组其次，小剂量组最少，三组均呈现先升高后降低的趋势，第14天达到高峰，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：松弛素对放射性肺损伤的形成过程中有重要的调控作用，且肺损伤程度越重，其作用越强。

松弛素；放射性肺损伤；肺纤维化

放射性治疗已经成为肺癌、乳腺癌、食道癌等胸部肿瘤患者的主要治疗手段，但在进行治疗的同时，由于肺组织对放射线中度敏感，肿瘤附近的肺组织可能出现不同程度的损伤，我们称之为放射性肺损伤。放射性肺损伤其实质为无菌性的炎症，其发生不可逆转，包括早期的放射性肺炎和后期的放射性肺纤维化，早期有干咳、少痰、发热、气短和胸部不适，以后可出现逐渐加重的干咳和呼吸困难[1]，以上症状往往严重影响患者的生活质量。肺纤维化从起始到病情恶化,进而导致呼吸功能不全，最后导致而死亡一般在5年左右，其发病机制复杂，治疗较困难[2]。松弛素是体内存在的一种天然的抗纤维化物质，它不仅能抑制胶原合成、沉积，成纤维细胞活化、增殖、分化以及上皮或内皮细胞间质转化，还可以增强胶原纤维降解。松弛素在心脏、肾脏中的作用已较明确，研究发现，松弛素基因剔除的雄性小鼠可以出现与年龄相关的，以心脏、肾脏为主的全身多器官纤维化[3]。有最新研究表明，对心脏、肾脏纤维化的松弛素基因敲除小鼠给予重组二型人类松弛素治疗两周后，肺内胶原的沉积明显减少。另外，在自发性高血压大鼠模型中，松弛素可显著降低左心室和肾脏的胶原蛋白含量，说明松弛素可同时改善心脏和肾脏的纤维化[4]。本实验通过建立放射性肺损伤的动物模型，观察松弛素在各组的表达情况及差异，推测松弛素在放射性肺损伤的形成过程中起着非常重要的调控作用，并且其含量的高低可能成为预测肺损伤严重程度的重要指标。

1 材料与方法

1.1 材料

X线定位机、直线加速器，德国西门子公司。

健康清洁级Wistar大鼠70只，雌雄各半，6～8周龄，体重(220±20)g，购于大连医科大学动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 随机将70只大鼠分为对照组(10只)，高剂量组(20只)，中剂量组(20只)，低剂量组(20只)，常规饲养1周无异后纳入实验。

1.2.2 动物的固定和照射：全部大鼠以10%水合氯醛3.5mL/kg腹腔注射麻醉。将大鼠保持仰卧位，四肢固定于老鼠板上，头部和胸部以下部位分别使用5cm厚的铅砖遮挡，露出胸部为照射区域， 常规X线模拟机定位，以腋窝顶部为上界，剑突下缘为下界，，腋窝外侧缘为外侧，射野面积4.0cm×5.0cm，界源皮距110cm。照射剂量分别为高剂量组：25Gy，中剂量组：20Gy，低剂量组：12Gy。对照组麻醉后佯装照射。

1.2.3 大鼠一般状态观察：精神状况，进食、饮水情况，体重变化，是否出现脱毛、皮肤溃疡等。

1.2.4 鼠肺大体标本观察及病理学观察：于照射后1、7、14、28d4个时间点麻醉大鼠，固定大鼠后，结扎气管后剖开胸腔分离主气管，并快速将气管及双肺剥离出胸腔，观察肺的大体结构改变。取右肺中叶于10%甲醛溶液中固定24h后，常规行石蜡包埋、切片、染色，光镜下观察肺组织结构变化。

1.2.5 鼠肺松弛素mRNA含量测定：使用组织RNA快速提取试剂盒提取，严格按照说明书操作，所有器具使用前采用0.1%DEPC水浸泡过夜，高温高压蒸汽灭菌，以去除RNA酶的污染，操作过程中会接触各种有毒物质，需谨慎小心，提取成功后测定RNA的纯度和浓度。应用cDNA合成试剂盒及荧光染料RT-PCR试剂盒行逆转录及实时荧光定量PCR。引物序列如下：relaxin：上游CCACTGCAGAAGTTGTGCCATC，下游ACAACGGAATCGCTCAACGC，β-action：上游CCCATCTATGAGGGTTACGC,下游TTTAATGTCACGCACGATTTC。

1.3 统计学方法

釆用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析。运用单向方差分析方法进行统计，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般状态观察

实验过程中无动物死亡。对照组大鼠精神及饮食、活动正常，皮毛有光泽；低剂量一般情况尚可，饮食及体重变化不明显；中剂量组、高剂量组照射后均出现精神不振，活跃程度较对照组明显减弱，对刺激反应迟钝，皮毛无光泽，进食及饮水减少，体重明显减轻，体重变化于第一周时较明显，以后逐渐恢复，以上表现高剂量组更明显。部分出现背部皮毛脱落、皮肤糜烂及浅溃疡，病变持续至实验结束，个别大鼠出现呼吸困难，呼吸频率加快，胸廓膨隆。

2.2 鼠肺大体观察

对照组肺组织呈粉红色，弹性良好，无充血水肿等表现；低剂量组肺组织弹性良好，表面光滑，肉眼观察改变不明显；中剂量组及高剂量组第7、14天可见肺组织轻度肿胀，弹性较好，表面及切面可见散在的点状出血，28d左右可见肺组织中度肿胀，弹性一般，为斑片状或片状出血点，肺叶颜色明显加深，呈暗红色，高剂量组较中剂量组明显。

2.3 鼠肺组织结构观察

对照组大鼠肺组织光镜下结构清晰，肺泡壁完整、薄而光滑，血管正常，肺泡腔内未见明显渗出；照射组第1、7、14天可见肺泡壁毛细血管轻度充血水肿，肺泡腔内可见淡红色水肿液，肺泡腔及肺泡间隔内有较多的中性粒细胞浸润，高剂量组表现最为显著；中剂量组及高剂量组第28天可见肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内及肺泡间隔可见纤维素样渗出物及大量淋巴细胞、单核细胞浸润(见图1、图2)，后者较明显。

图1 高倍镜下(×400)可见大量慢性炎症细胞

图2 高倍镜下(×200)可见肺泡间隔增宽，纤维蛋白沉积

2.4 肺组织松弛素mRNA表达

松弛素在对照组肺组织中为弱表达，在照射组中，照射后随照射组时间的延长表达量逐渐增多，第14天达到高峰，后缓慢下降，呈现先升高后降低的趋势，明显高于对照组，其中高剂量组较中、低剂量组其升高的趋势更加显著，差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

图3 四组大鼠肺组织中松弛素mRNA的相对含量

3 讨论

松弛素是1926年Hisaw等人在猪体内发现的一种具有松弛耻骨韧带作用的多肽类激素，其结构与胰岛素类似，主要来源为妊娠黄体，近些年动物模型证实，松弛素可能来源于肾脏、心血管、中枢神经系统、胃、十二指肠等全身多个器官[5]。它可以作为一种全身性的激素进入血液循环，也可以只起局部激素的作用。最初，松弛素被认为是一种与生殖相关的激素，在妊娠期它可以起着松弛结缔、肌肉组织和抑制子宫肌收缩、软化宫颈的作用，但随着对其结构和机制的更进一步探索，发现它不仅在生殖系统发挥重要的作用，对心血管系统也起着保护作用，还具有抗炎、促进伤口愈合、加速前列腺癌等肿瘤的进展、抗纤维化的作用。

松弛素抗纤维化的作用主要体现在：①抑制前纤维化因子，如转化生长因子β1[6](TGFβ1)、血管紧张肽Ⅱ等；②抑制纤维母细胞增殖和分化，减少成纤维细胞合成胶原蛋白；③刺激金属蛋白酶(MMP)，诱导基质降解。另外对于已经形成瘢痕(纤维化) ，松弛素能明显减轻其严重程度。在心脏和肾脏纤维化的研究中，松弛素的作用已经得到了充分的证明[7]，它可以作为一种内源性的保护因子减缓心脏、肾脏纤维化的进展。

MOOKERJEE等人[8]，通过对松弛素基因敲除小鼠和野生型小鼠腹腔注射卵清蛋白致敏后，结果显示松弛素基因敲除小鼠较野生型小鼠和的肺胶原沉积量显著增多(P<0.05)，并且进一步提示金属蛋白酶-9的减少与胶原含量增多有关，这项研究提示，在过敏性炎症过程中，松弛素可以起着抑制肺胶原沉积的作用。还有国外研究表明，松弛素缺失的小鼠会出现与衰老相关的肺纤维化、肺组织质量增加、胶原含量增加、肺泡充血和细支气管上皮细胞肥厚、肺泡结构变形、最大呼气流量升高、吸气末停顿缩短，而通过松弛素的治疗可以使过多的胶原沉积得到逆转。以上研究均表明，松弛素在肺组织纤维化形成过程中起着一定的抑制作用。而关于松弛素对放射性肺损伤引起的放射性肺炎及放射性肺纤维作用，国内尚未得到充分研究和证明。本研究提示，松弛素在放射性肺损伤形成肺纤维化的过程中起着非常重要的调控作用，同时它与放射性肺损伤的严重程度呈现相反的趋势，可以成为将来临床上预测放射性肺损伤程度的重要因子，同时可以为放射性肺损伤的防治提供新的思路。

[1]王丽，冯炎．放射性肺损伤的研究进展[J]．中国肺癌杂志，2004，7(5)：462-464

[2]鲍文华,赵丽丽.硫化氢在大鼠肺纤维化中的表达[J].黑龙江医药科学, 2009, 32(1):45-46

[3]TakedaN，ManabeI．Cellularinterplaybetweencardiomyocytesandnonmyocytesincardiacremodeling[J]．IntJInflam，2011，11：535241

[4]SamuelCS，CendrawanS，GaoXM，etal．Relaxinremodelsfibrotichealingfollowingmyocardialinfarction[J]．LabInvest，2011，91(5)：675-690

[5]周艳娜,吴氢凯,甘桂萍.松弛素生物学作用研究进展[J].临床和实验医学杂志, 2014, 13(19):1651-1652

[6]JasonJ,GajarsaR,Kloner.Leftventricularremodelinginthepost-infractionheart:areviewofcellular,molecularmechanisms,andtherapeuticmodalities[J].HeartFailRev, 2011, 16(1):13-21

[7]朱艳艳，张怀勤.松弛素抗纤维化作用的研究进展[J].医学综述, 2014, 20(15):2714-2716

[8]Mookerjee，Sollynr，RoyceSG．Endogenousrelaxinregulatescollagendepositioninananimalmodelofallergicairwaydisease[J]．Endocrinology，2006，147(2)：754-761

The expressions and roles of relaxin on the radioactive lung injury of rats

WANGXiao-xi,BAOWen-hua,ZHONGQuan,MAXue-mei,WENRui,SUNYun-hui

(The Department of Respiration, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Objective: To investigate the expression and function of relaxin in radioactive lung injury model in rats in different doses. Methods: High, medium and low doses of radioactive lung injury animal models were established. Fluorescent quantitative PCR method was used to measure relaxin mRNA expression in the lung tissue after 1 day, 7 days, 14 days, 28 days. after HE was stained, the lung tissue pathological changes were observed.Results: the highest relaxin mRNA expression quantity was in high dose group, the second in medium dose group, and the least in low dose group. Three groups tended to reduce after the first rise. On the 14th day, the expression reached its peak, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: In the process of the formation of radioactive lung injury, relaxin plays an important role in regulating, and the degree of lung injury is heavier, the role of it is stronger.

relaxin; radioactive lung injury;pulmonary fibrosis

王晓茜(1990～)女，湖北荆门人，在读硕士研究生。

孙云晖(1970～)女，黑龙江虎林人，硕士，教授，主任医师，硕士研究生导师。E-mail：394849603@qq.com。

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1008-0104(2017)02-0082-03

2015-12-11)