孙 庆，季庆辉，刘智勇，吕思锐，李 煜，高博一

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死实验研究①

孙 庆，季庆辉，刘智勇，吕思锐，李 煜，高博一

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的:探讨黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死疗效及促进成骨作用。方法：分成①对照组6只；②模型组6只；③髓芯减压组6只；④髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC组6只。兔股骨头坏死模型制备采用液氮冷冻法诱导。结果：在8周时，髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC组骨细胞形成致密饱满、量大清晰、増生活跃，造血细胞丰富，有较密骨小梁结构出现，骨密度出现最高现象。结论：黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死，黄芪甲苷诱导MSC转化为成骨细胞, 髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死8周时有较密骨小梁结构出现，骨密度最高。

黄芪甲苷；诱导；MSC；治疗；兔股骨头坏死

股骨头坏死(股骨头坏死症状、股骨头无菌性坏死、股骨头缺血性坏死)常发生部位股骨头。病因主要有：①股骨颈骨折复位不良的愈合；②骨组织自身病变两种。常见症状：①持续痛；②静息痛；③关节活动与负重行走功能障碍[1]。股骨头坏死(股骨头坏死症状、股骨头无菌性坏死、股骨头缺血性坏死)是一个病理演变过程。初始发生于股骨头负重区，然后在应力作用下坏死骨骨小梁结构发生损伤(显微骨折及针对损伤骨组织修复)[2～4]。本实验通过研究探索黄芪甲苷(黄芪皂苷Ⅳ)(AstragalosideIVbeta-D-Glucopyranoside)体外诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)移植修复股骨头坏死实验硏究。

1 材料和方法

1．1 实验动物

新西兰大白兔24只,体重(2200±200)g, 6月龄，雌雄各半，由佳木斯大学动物实验中心提供。

1．2 试剂与实验仪器

①主要试剂。黄芪甲苷(CAS号：84687-43-4，成都瑞芬思生物科技有限公司)；75%医用酒精(衡阳原野实业有限公司)；甲醇溶液(丽英化工公司)；爱特福84碘伏(江苏爱特福84股份有限公司)；盐酸标准溶液(实验室标准溶液 0.01mol，天津市致远化学试剂有限公司)；多聚甲酸(临沂瑞银化工有限公司)；二甲苯(上海昊化化工有限公司)；无水乙醇(山东光讯化工有限公司)；丙二醇(河南明利化工产品有限公司)；戊巴比妥(北京普博斯生物科技有限公司)；青霉素(合肥博美生物科技有限责任公司)；速眠新Ⅱ注射液合剂(吉林省敦化市圣达药品有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)(浙江扬帆新材料股份有限公司)。

②实验仪器。常规手术器械(佳木斯大学临床医学院实验室)；一次性无菌手术包(揭阳市善笙医疗器械有限公司)；一次性无菌注射器(南京童文医疗器械有限公司)；一次性无菌备皮刀(衡水滨湖新区永刚医疗器械厂)；动物备皮用电推剪(衡水滨湖新区永刚医疗器械厂)；飞利浦PHILIPS电推剪(飞利浦(中国)投资有限公司)；12号骨髓穿刺针(温州市龙湾永兴凯恩特金属制品厂)；200W微量加样器(长沙科怡仪器设备有限公司)；液氮(海南佳腾化工气体有限公司)；8CA-V图像生物显微镜(上海光学仪器五厂有限公司)；ZeissLSM800激光共聚焦显微镜(德国卡尔蔡司公司)。

1．3 兔股骨头坏死模型制备及诊断

①兔股骨头坏死模型制备。液氮冷冻法[5]诱导兔股骨头坏死：30mg/g戊巴比妥或50mg/kg腹腔麻醉→髋关节前位置4cm左右→生理盐水湿润→贴皮肤剪除毛发→爱特福84碘伏皮肤消毒→无菌备皮刀备皮→爱特福84碘伏消毒→切外斜形口→切开皮肤→皮下组织→深筋膜→暴露髋关节囊→T形切开髋关节囊→股骨头暴露→纱布团浸透液氮→冷冻股骨头上端→持续10min→湿盐水纱布股骨头上端复温→复位→缝合切口各层。新西兰大白兔股骨头坏死模型制备术后2次/d肌肉注射青霉素20万单位，连续3d预防伤口感染。

②兔股骨头坏死模型诊断。造模是否成功观察术后兔股骨头坏死模型如下方面：a一般状态；b术口；c称重；dCT检测。造模是否成功观察术后兔股骨头坏死模型具体情况,见表1。

表1 观察术后兔股骨头坏死造模情况

1．4 兔骨髓间充质干细胞分离培养

pittenger方法[6]骨髓间充质干细胞取自新西兰大白兔自体，肌肉注射速眠新Ⅱ注射液合剂麻醉新西兰大白兔，无水乙醇消毒髂骨12号骨髓穿刺针穿刺抽取骨髓5mL，收集细胞用巴氏吸管吸入15mLBD管中，收集细胞加入PBS稀释2倍混合均匀，采用密度梯度离心percoll(密度1.073g/mL)液面上，2000r/min离心20min取中层云雾状细胞层， 10cm细胞培养皿加入100mL/L胎牛血清培养液2×105云雾状细胞接种，37℃50mL/LCO2培养箱中培养5d后第1次冲去红细胞换液，纤维细胞克隆贴壁生长0.25%胰蛋白酶消化，1/2培养孔长满细胞, 1×106/cm2密度移入细胞培养瓶。细胞培养瓶内第3代细胞长满消化细胞，配置成2×106/cm2悬液细胞，每个股骨头准备含细胞悬液50μL，共10万个细胞, 孵育4h细胞培养箱中备用[7]。

1．5 黄芪甲苷母液制备。

黄芪甲苷7.84mg溶于10mLPBS液充分溶解,制成1×10-3mol/L母液,微孔过滤器(0.22μm)过滤除菌4℃保存。二甲基亚砜(DMSO)10～20μL加入过滤除菌母液充分溶解，再加入PBS液定容至l0mL。

1．6 兔股骨头坏死模型注射成骨细胞

30mg/g戊巴比妥或50mg/kg腹腔麻醉→髋关节前位置4cm左右→生理盐水湿润→贴皮肤剪除毛发→爱特福84碘伏皮肤消毒→无菌备皮刀备皮→爱特福84碘伏消毒→大转子下缘1cm处纵向切口→电转安装直径1mm定位针→直径1cm空心钻扩髓→拔出定位针→插入5mL—次性无菌注射器针头→注入黄芪甲苷体外诱导骨髓干细胞和基质胶混合物(成骨细胞约200万个)→拔除导管针→骨蜡诸塞骨髓道→骨蜡封口→股骨头颈倒置l0min→基质胶凝固定位→缝合术口。

1．7X线和螺旋CT检測兔股骨头坏死修复情况

选取24只健康新西兰大白兔，①对照组6只；②模型组6只；③髓芯减压组6只；④髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC组6只。

1．8 统计学方法

采用SPSS19.0分析处理,计算平均数和标准差，采用t检验。

2 结果

2.1 黄芪甲苷体外诱导MSC生长观察

黄芪甲苷体外诱导MSC培养生长第5d纤维细胞克隆贴培养瓶壁生长。0.25%胰蛋白酶消化传代2～4h纤维细胞贴壁生长，传代2～3d长满细胞培养瓶底。传代2～7d纤维细胞指数生长倍增时间48h。黄芪甲苷体外诱导原代MSC见图1。

图1 黄芪甲苷体外诱导原代MSC(20×40)

2.2 肉眼结合病理组织学观察

通过肉眼观察新西兰大白兔股骨头坏死结合病理组织学了解四组股骨头坏死发展及修复过程，见表2。

表2 观察术后兔股骨头坏死造模情况

2.3Micro-CT检測兔股骨头坏死骨密度修复情况

通过检测X线和螺旋CT检測①对照组；②模型组；③髓芯减压组；④髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC组兔股骨头坏死检测兔股骨头坏死所得骨结构参数指标BMD，见表3。BMD骨密度或骨矿物质密度(BoneMineralDensity,BMD),3DBMD单位是mg/cc。治疗组(髓芯减压组和髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC组)与模型组比较，说明统计学上显著性差异(P<0.05)。

表3 检测兔股骨头坏死指标±s，8周)

注：aP<0.01

2.4X线检测兔股骨头坏死情况

新西兰大白兔手术后4、8周X线检测股骨头坏死情况，麻醉兔后采用仰卧X线检测股骨头坏死情况，见表4。

表4 X线检测各处理兔股骨头坏死情况(8周)

3 讨论

股骨头坏死(俗称骨蚀、股骨头无菌性坏死、股骨头缺血性坏死)主要病理是股骨头血运受阻，遭受破坏引起股骨头骨质缺血，故称为股骨头缺血性坏死或股骨头无菌性坏死。常见类型：①激素性股骨头坏死；②酒精性股骨头坏死；③外伤性股骨头坏死；④老年股骨头坏死；⑤儿童股骨头坏死。股骨头坏死症状：①早期症状： 疼痛行走活动后加重，有时为休息痛。多为针刺样疼痛、钝痛或酸痛不适等，常向腹股沟区，大腿内侧，臀后侧和膝内侧放射，并有麻木感。出现间歇性跛行，儿童患者更为明显。②晚期症状：髋关节各方向活动受限，肢体短缩，屈曲内收挛缩畸形，肌肉萎缩。易患股骨头坏死5类人群：①长期酗酒人群；②患有某些基础疾病人群；③某些特殊职业人群；④长期服用激素人群；⑤有过髋部外伤患者人群[8]。

股骨头坏死发病机制目前尚不清楚，是由复杂多因素导致股骨头坏死病理过程。国内一般采取保守治疗股骨头坏死方式，口服中药、外敷膏药、配合功能锻炼。晚期患者根据自己病情与经济条件来选择治疗方式，如手术。孙强[9]等激素性股骨头坏死的发病主要与脂肪代谢紊乱有关。刘忠堂[10]等激素所致的股骨头缺血坏死是多种因素引起股骨头血液循环障碍, 导致骨坏死；而酗酒使血中游离脂肪酸升高, 前列腺素增多, 易发生血管炎而栓塞, 以致骨缺血坏死。黄可[11]等使用普伐他汀干预能有效降低乙醇引起的高脂血症、血小板黏附及红细胞聚集，防止骨细胞的损伤，从而预防AOFH的发生。刘沛霖[12]等葛根素能够抑制酒精性股骨头坏死的发生, 并能够预防骨坏死。张文进[13]活骨注射液能够増强兔坏死股骨头局部VEGF、bFGF和IGF-1的表达使血管再生増强,有利于缺血性股骨头坏死的修复。李磊[14]髓芯减压过程中注入经淫羊藿体外诱导骨髓间充质干细胞明显促进股骨头坏死修复。

骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是未分化细胞或原始祖细胞，具有慢周期性和自我更新能力。MSC来源广泛，易于分离培养，具有较强分化潜能和可自体移植等优点，不久即将被引入临床治疗最优干细胞。

实验研究黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死发现髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC组骨细胞形成致密饱满、量大清晰、増生活跃，造血细胞丰富，有较密骨小梁结构出现，骨密度出现最高现象。

实验结果证实黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死，黄芪甲苷诱导MSC转化为成骨细胞, 髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死8周时有较密骨小梁结构出现，骨密度最高。髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死实验组与兔股骨头坏死模型组相比表现显著差异性，说明黄芪甲苷体外诱导MSC治疗兔股骨头坏死有效，髓芯减压联合黄芪甲苷体外诱导MSC治疗效果更佳。

[1]张富运，杨建华，王蕾，等. 骨髓单个核细胞对大鼠脊髓损伤后行为功能影响的研究[J]. 黑龙江医药科学，2013，36(6):44-46

[2]赵中男，杨建华，王莹，等. 骨髓单个核细胞移植对脊髓半横断大鼠损伤组织中髓鞘碱性蛋白表达的影响[J]. 黑龙江医药科学，2014，37(1):43-45

[3]张立超，贺涛，帅逸，等. 正常大鼠的骨髓间充质干细胞对去势大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响[J]. 黑龙江医药科学，2016，39(2):93-95

[4]徐志刚，吕淑慧，刘远光，等. 骨髓间充质干细胞向光感受器样细胞和视网膜神经样细胞的分化及移植后的分布情况[J]. 黑龙江医药科学，2013，36(1):58-60

[5]沈霖，林燕萍，王拥军.骨伤科实验研究[M].北京：科学技术出版社，2005

[6]PittengerMF,MackayAE,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadualthumanmesenchymalstem[J].CellsScience，1999，28(4):143-147

[7]季庆辉，申福国，孔维丽，等. 骨髓单个核细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤后髓鞘碱性蛋白表达影响[J]. 黑龙江医药科学，2015，38(1):66-68

[8]武广海，田黎明，于广晴，等.RT-PCR检测SALL4基因骨髓增生异常综合征的表达[J]. 黑龙江医药科学，2016，39(2):96-98

[9]孙强，施裕新，张其恭，等.激素性股骨头坏死发病机制的实验研究[J].中国临床医学,2003,10(4):465

[10]刘忠堂，王坤正，池永龙. 酒精和激素性股骨头缺血性坏死发病机制的实验研究[J]. 温州医学院学报，1999,29(3):184-187

[11]黄可，唐毓金.普伐他汀对酒精性股骨头坏死干预作用的实验研究[J] .重庆医学，2013,42(9):974-976，979

[12]刘沛霖，李月白，王义生.葛根素预防酒精性股骨头坏死的初步实验研究[J] . 中原医刊，2006，33(7):17-19

[13]张文进. 中药活骨注射液对兔股骨头缺血性坏死修复过程中的VEGF、bFGF、IGF-1、bcl-2、bax和caspase-3表法情况实验研究[D]. 黑龙江中医药大学，2016

[14]李磊. 淫羊霍昔诱导骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死的实验硏究[D]. 广州中医药大学,2016

1.佳木斯大学大学生科技创新项目，编号：xsym2016-01；2.黑龙江省大学生创新创业训练计划重点项目，编号：201510222013；3.佳木斯大学科学技术重点项目，编号：12Z1201508；4.佳木斯大学附属第一医院院级培育课题，编号：2014年。

孙庆(1994～)男，黑龙江佳木斯人，在读本科学生。

季庆辉(1983～)男，黑龙江黑河人，硕士，主治医师，讲师。E-mail:jqinghui1983@163.com。

R

B

1008-0104(2017)02-0042-03

2017-01-05)