林波，郑凤锦，方晓纯，孙健，陈赶林

（1.广西大学，广西南宁530007；2.广西农业科学院农产品加工研究所，广西南宁530007；3.广西农业科学院，广西南宁530007）

甘蔗汁多酚氧化酶的提取研究

林波1，2，郑凤锦2，方晓纯2，孙健2，陈赶林3，*

（1.广西大学，广西南宁530007；2.广西农业科学院农产品加工研究所，广西南宁530007；3.广西农业科学院，广西南宁530007）

以磷酸盐缓冲液匀浆浸提法提取混合甘蔗汁多酚氧化酶（PPO），探讨缓冲液pH值、表面活性剂添加量和聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）添加量对甘蔗汁PPO提取效果的影响。结果表明，以邻苯二酚为底物时，获得甘蔗汁PPO的酶活性最适测定波长是230 nm。磷酸盐缓冲液提取甘蔗汁PPO最适pH值为6.2；在磷酸盐缓冲溶液中PVPP最适添加量为2%，提取甘蔗汁PPO的比活性最高。在缓冲液中加入表面活性剂Tween80和TritonX-100时，提取甘蔗汁PPO的比活性较低。

甘蔗汁；多酚氧化酶；提取；活性

广西是国内最大的甘蔗种植区和产糖区，甘蔗含糖量高，其糖分由蔗糖、果糖、葡萄糖3种成分构成，约占18%～20%，是主要的制糖原料。此外，甘蔗还含有天门冬酸、天门冬氨酸、丙氨酸、柠檬酸、维生素A、维生素C、尼克酸、核黄素及铁、钙、磷、锰、锌等营养物质，其中铁含量为9 mg/kg，居水果之首[1-2]。医学研究表明，甘蔗汁中富含多酚和黄酮类物质，具有较强的抗氧化能力、抗突变能力、抗炎能力以及酪氨酸酶抑制能力[3-4]。

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，简称PPO）是果蔬体内普遍存在的一类含铜的氧化还原酶。果蔬组织中发生的褐变现象主要是由于PPO催化富含在果蔬中的酚类物质的氧化反应所引起的[5]。由于PPO广泛分布于植物界乃至动物界，且其检测方法方便快捷，因此，对于果蔬PPO的提取、纯化及其特性等，国内外学者们展开了大量的研究以及应用。

学者们对杨桃[5]、苹果[6]、香蕉[7]、蜜柚[8]、木瓜[9]等果蔬的PPO进行了很多研究，到目前为止，对甘蔗PPO的研究都大多是在甘蔗组织培养和生理等领域，对控制甘蔗发酵防止酶促褐变的研究极少，前期何思莲[10]对甘蔗PPO的提取分离工艺仅做了初步研究，本试验在其基础上，对新鲜混合甘蔗汁PPO进行提取研究，考察提取因素对甘蔗汁PPO的影响，为今后甘蔗汁深加工中抑制酶促褐变提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜混合甘蔗汁（已压榨好的糖料甘蔗蔗汁，甘蔗品种为桂糖系列品种）：2015年11月由广西农业科学院甘蔗研究所提供；Tween80、TritonX-100、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、邻苯二酚：国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PGL精密天平：深圳市怡华新电子有限公司；B4-1A磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；3K-15高速冷冻离心机：德国SIGMA离心机有限公司；GENESYS 10S紫外可见分光光度计：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甘蔗汁PPO的提取方法

在冷藏（4℃）后的新鲜混合甘蔗汁中加入预冷（4℃）过的磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）和聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），振荡混匀30 min后在9 500 r/min、4℃下离心30 min，收集上清液，上清液即为甘蔗汁PPO粗酶液。

1.3.2 甘蔗汁PPO活性最适波长的测定

参考Yang等[11]报道的分光光度计比色法进行测定。酶反应混合液由3.9 mL磷酸盐缓冲溶液（0.1mol/L，pH值7.0）、1 mL邻苯二酚（0.01 mol/L）和0.1 mL酶液组成。将混合液在30℃下反应5 min，在波长200 nm～600 nm扫描范围内测定反应产物吸光度值的变化，将最大吸收峰处的波长确定为测定甘蔗汁PPO的最适波长。

1.3.3 甘蔗汁PPO活性测定

按照1.3.1方法提取甘蔗汁PPO酶液。将混合液在30°C下反应5 min，在最适波长下测定反应产物吸光值的变化。将1 mL酶液反应后1 min吸光度值（OD230）增加0.01定义为1个酶活性单位（1 U）。

1.3.4 甘蔗汁PPO蛋白质含量的测定

按照1.3.1方法提取甘蔗汁PPO酶液。参考《果蔬采后生理生化实验指导》果蔬中可溶性蛋白质含量的测定——考马斯亮蓝染色法[12]。

1.3.5 甘蔗汁PPO比活性

比活性是1 mg酶蛋白所具有的酶活性单位数，一般用U/mg蛋白来表示。酶的比活性越高，其纯度越高。计算公式为：

比活性=酶活性单位数（U）/蛋白质含量（mg）

1.3.6 提取因素对甘蔗汁PPO提取的影响

1.3.6.1 缓冲液pH对甘蔗汁PPO提取的研究

分别配制pH值为6.0～7.2（以0.2为间隔）的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，使用上述提取条件提取甘蔗汁PPO酶液，进行酶的比活性的测定与比较。

1.3.6.2 添加表面活性剂对甘蔗汁PPO提取的研究

在pH值7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液中，分别添加1%、2%、3%的Tween 80和1%、2%、3%的Triton X-100，提取甘蔗汁PPO酶液，进行酶的比活性的测定与比较。

1.3.6.3 不同添加量的PVPP对甘蔗汁PPO提取的研究

在pH值7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液中，分别加入0%、1%、2%、3%、4%、5%的PVPP，提取甘蔗汁PPO酶液，进行酶的比活性的测定与比较。

2 结果与分析

2.1 测定甘蔗汁PPO活性的最适波长

按照上述方法提取甘蔗汁的粗酶液，将混合液在30℃下反应5 min，在波长200 nm～600 nm范围内扫描混合反应液，测定反应产物吸光度值的变化，将最大吸收峰处的波长确定为测定混合甘蔗汁PPO的最适波长，结果见图1。

图1 甘蔗汁PPO与邻苯二酚作用后产物的吸收峰Fig.1Absorption peaks of PPO and catechol in sugarcane juice

从图1可见，通过波长扫描反应液，在230 nm和290 nm处出现两个紫外吸收峰，尤其是230 nm处吸收峰最高，较明显；而290 nm处的吸收峰较小，这可能是其他酶类与底物邻苯二酚反应的结果。何思莲[10]报道以邻苯二酚为底物，甘蔗PPO提取物与底物反应所得产物的最大吸收波长为410 nm，与本试验使用相同的底物，但得到不同的酶促反应产物的最大吸收波长，这可能是由于使用不同的原料，报道中使用的原料是台糖22甘蔗品种，而本试验中使用的是桂糖系列品种且新鲜压榨并混合的甘蔗汁，每个甘蔗品种的PPO含量不一样，这可能造成使用相同的底物，但测定得到不同的最大吸收波长。同时，为了观察热处理后甘蔗PPO的变化，对煮沸后的甘蔗汁PPO也进行测定，以邻苯二酚为底物测定酶促反应产物最大吸收波长也是在230 nm处。

由此可知混合甘蔗汁PPO与底物邻苯二酚作用后的产物最大吸收峰出现在230 nm处。表明以邻苯二酚为底物时，甘蔗汁PPO的酶活测定的最适波长是230 nm。

2.2 缓冲液pH值对甘蔗汁PPO提取的影响

以不同pH值（6.0～7.2，以0.2为间隔）的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，按照1.3.1提取方法，提取混合甘蔗汁PPO酶液，进行酶的比活性的测定与比较，结果见图2。

图2 不同pH值的磷酸盐缓冲液对甘蔗汁PPO提取的影响Fig.2Effect of phosphate buffer with different pH value on extraction of PPO from sugarcane juice

从图2可见，在测定波长为230 nm，以pH 6.0～7.2的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液作为提取液的条件下，甘蔗汁PPO的比活性随着pH值的增加而降低，在pH 6.0时，提取甘蔗汁PPO的比活性最大；从pH 6.2开始，甘蔗汁PPO的比活性开始降低；在pH 6.4～7.0时，提取的甘蔗汁PPO比活性相差不多；在pH 7.2时，提取的甘蔗汁PPO比活性最低。这表明PPO的溶解度和稳定性与磷酸盐缓冲液的pH值有关，pH值过高或过低都不利于甘蔗汁PPO的提取，但与测定的波长关系不大，综合考虑下，提取甘蔗汁PPO的最适pH值为6.2。

2.3 添加表面活性剂对甘蔗汁PPO提取的影响

按照1.3.1提取方法，在pH 7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液中添加表面活性剂提取混合甘蔗汁PPO酶液，进行酶的比活性的测定与比较，结果见表1。

从表1可知，添加表面活性剂对甘蔗汁PPO的提取有显著的影响。添加表面活性剂Tween 80和Triton X-100的酶活性U和酶液比活性都随着表面活性剂浓度的增加而降低，而可溶性蛋白质的含量却随着浓度的增加而增加，这可能是表面活性剂提高了其他杂蛋白的提取；对比两种表面活性剂对甘蔗汁PPO提取的效果，浓度1%～2%Tween 80表面活性剂比Triton X-100表面活性剂的提取效果要好一些，酶活性U和比活性的数值要高一些，但比活性都比未添加表面活性剂的CK处理数值低，由此可见，添加表面活性剂的浓度应在最适范围之内。

表1 添加表面活性剂对甘蔗汁PPO提取的影响Table 1Effect of surfactant addition on PPO extraction of sugarcane juice

2.4 不同PVPP添加量对甘蔗汁PPO提取的影响

按照1.3.1提取方法，在pH 7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液中，加入不同添加量的PVPP，对甘蔗汁PPO酶液提取，进行酶的比活性的测定与比较，结果见图3。

图3 不同添加量的PVPP对甘蔗汁PPO提取的影响Fig.3Effect of PVPP with different dosage on the extraction of PPO from sugarcane juice

由图3可见，在磷酸盐缓冲溶液中，加入不同添加量的PVPP影响甘蔗汁PPO酶液的提取效果。其中添加量为2%的PVPP提取甘蔗汁PPO的比活性最高，这可能是PVPP通过与甘蔗汁中的多酚类物质形成氢键络合物沉淀下来，并吸附些杂蛋白，从而提高酶液的比活性；而当PVPP的添加量增加时，甘蔗汁PPO的比活性也随之降低。可见，在波长230 nm处，磷酸盐缓冲溶液中PVPP的最适添加量为2%，提取甘蔗汁PPO的比活性最高。这方法比何思莲[10]的报道中使用吸光度值法测定PVPP澄清的提取液，提取效果更明显，更有效地说明PVPP最适添加量为2%，同时也说明使用不同波长（420 nm和230 nm）测定甘蔗汁PPO中PVPP的添加量都为2%，不同的波长扫描测定对PVPP添加量的影响不大，PVPP添加量对植物液中的多酚类物质和蛋白质具有较好的吸附作用。

3 结论

在以磷酸盐缓冲液匀浆浸提法提取混合甘蔗汁PPO时，考察缓冲液的pH值、表面活性剂和PVPP的不同添加量对混合甘蔗汁PPO提取效果的影响。试验结果表明，以邻苯二酚为底物时，混合甘蔗汁PPO酶促反应测定的最适波长为230 nm。在酶促反应产物最大吸收波长230 nm处，磷酸盐缓冲液提取混合甘蔗汁PPO的最适pH为6.2，PVPP最适添加量为2%，提取混合甘蔗汁PPO的比活性最高。在缓冲液中加入表面活性剂Tween 80和Triton X-100的提取效果都比未加入表面活性剂的要低些，故在使用磷酸盐缓冲液匀浆浸提法时不宜加入表面活性剂提取混合甘蔗汁PPO。

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The Extraction of Polyphenol Oxidase from Sugarcane Juice

LIN Bo1，2，ZHENG Feng-jin2，FANG Xiao-chun2，SUN Jian2，CHEN Gan-lin3，*
（1.Guangxi University，Nanning 530007，Guangxi，China；2.Agro-food Science and Technology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China；3.Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China）

Polyphenol oxidase（PPO）was extracted from mix sugarcane juice by phosphate buffer homogenate extraction.The effects of pH value，surfactant adding quantity and polyvinyl polypyrrolidone（PVPP）adding quantity on the PPO extraction were determined.The results showed that the optimal wavelength of enzymatic activity of PPO was 230 nm when catechol was used as substrate.The optimal pH value of PPO was 6.2.The optimal adding quantity of PVPP was 2%in phosphate buffer solution，and the highest specific activity of PPO was obtained in sugarcane juice.When adding surfactant Tween 80 and Triton X-100 in buffer，the specific activity of PPO in extracting sugarcane juice was low.

sugarcane juice；polyphenol oxidase；extraction；activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.011

2017-01-18

国家星火计划项目（2015GA790013）；广西科技计划项目（桂科AB16380244，桂科合14123001-10）；广西农业科学院基本科研业务专项（桂农科2015YZ02）

林波（1987—），女（汉），助理工程师，研究生，主要从事农产品加工与产品开发研究工作。

*通信作者：陈赶林（1980—），男（汉），副研究员，硕士，主要从事农产品加工与综合利用研究工作。