帅希祥 杜丽清 张明 涂行浩

摘 要 以冷榨澳洲坚果粕为原料，通过碱提酸沉法得到澳洲坚果蛋白，采用超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽；以水解度为指标，利用单因素试验与正交试验考察各因素对超声辅助酶解的澳洲坚果蛋白水解度的影响，同时采用ABTS自由基清除能力评价制备的澳洲坚果蛋白酶解液的抗氧化活性。结果表明：各因素对超声辅助酶解的澳洲坚果蛋白水解度的影响次序为：酶添加量>酶解时间>酶解初始pH值>超声功率，其最佳超声辅助酶解条件为酶解时间120 min、加酶量5.0%、超声功率300 W、酶解初始pH值10.0，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为22.90%，其6.0%的酶解液清除ABTS自由基的能力达92.59%。说明超声辅助酶解制备的澳洲坚果蛋白酶解液具有较强的抗氧化活性，可将其作为一种具有抗氧化作用的食品添加劑应用于食品工业。

关键词 超声波；酶解；澳洲坚果蛋白肽；抗氧化活性

中图分类号 Q949.739 文献标识码 A

Abstract With macadamia pulp as raw material， the protein of macadamia nut through alkali extraction and acid precipitation， study on the technology of macadamia nut peptide prepared by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis. The effects of four processing conditions on the degree of hydrolysis were explored by single factor and orthogonal array design methods in order to optimize these conditions. Meanwhile， the antioxidant activity of macadamia nut peptide was evaluated by ABTS scavenging activity. Results showed that the order of the factors was as follows： enzyme dosage>hydrolysis duration>pH>ultrasonic power， the optimized macadamia nut peptide hydrolysis parameters by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis was： hydrolysis at 300 W for 120 min with enzyme dosage 5.0%， hydrolysis buffer pH10.0. The hydrolysis degree of macadamia nut protein was 22.90%， with 92.59% of the ABTS scavenging activity， it had strong antioxidant activity by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis. It as a food additive has antioxidant properties， applied to food or health food industry.

Key words Ultrasonic wave； enzymatic hydrolysis； macadamia nut peptide； antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.014

澳洲坚果（Macadamia ternifolia F. Muell.）别名澳洲核桃、夏威夷果等，属山龙眼科澳洲坚果属多年生常绿乔木[1-3]。20世纪60～70年代开始引入中国，目前在中国广东、广西、云南及贵州等地均有种植[4]。随着澳洲坚果果树的大量栽种，资源越来越丰富，澳洲坚果产业已具备一定规模，但澳洲坚果的深加工产业比较滞后，目前主要用于榨油，榨油后会产生大量的澳洲坚果饼粕，其含有较高含量的蛋白质（32.25%），且含有17种氨基酸，总含量为25.05%[5]。科学研究发现，蛋白质经适当的蛋白酶水解可获得许多具有生物功能的生物活性肽，其易消化吸收，同时具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节等功能[6-8]。目前国内关于生物酶法制备澳洲坚果蛋白肽的研究已有一些报道[1，5]，但关于采用超声辅助酶解制备澳洲坚果蛋白肽及其抗氧化活性的研究较少。超声波产生的空化效应和机械效应对物质的提取、酶解反应及高分子的降解等具有一定的促进作用，在超声作用下进行酶解反应可以缩短酶解时间、提高酶解效率、增加产物得率[9-10]。

本研究以澳洲坚果粕为原料，通过碱提酸沉法得到澳洲坚果蛋白；以水解度为指标，探讨超声辅助酶解澳洲坚果蛋白的工艺优化，同时，采用2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除能力评价澳洲坚果蛋白酶解液的抗氧化活性，为澳洲坚果蛋白资源的精深加工及综合利用提供可靠的理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 坚果来源 澳洲坚果饼粕由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所休闲加工厂提供。

1.1.2 试剂 碱性蛋白酶（活力≥4 000 U/mg）、丝氨酸（99.99%）、ABTS（≥97%）、维生素C（阿拉丁化学试剂有限公司）；十水四硼酸钠、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、2，6-二叔丁基对甲酚、氢氧化钠、盐酸、过硫酸钾、无水乙醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.3 仪器与设备 主要实验仪器与设备如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 采用碱提酸沉法，工艺流程为：称取100 g澳洲坚果饼粕放入滤纸包中，用沸点在30～60 ℃的石油醚进行索氏提取（6 h）；取出晾干，按1 ∶ 50（w ∶ V）加入蒸馏水，用1.0 mol/L NaOH调pH至9.0，于45 ℃水浴磁力搅拌2 h；以4 800 r/min离心过滤10 min，将上清液pH调至4.5，于4 ℃冰箱冷藏过夜；离心，水洗3次，冷冻干燥48 h，得到澳洲坚果粗蛋白，通过测定得知其蛋白质含量为84.6%。

1.2.2 超声辅助酶解所得澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量的测定 超声辅助酶解所得澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽的含量参照Pedroche等[11]和Nielsen等[12]報道的o-邻苯二甲醛法（OPA）进行测定。

标准曲线的绘制：准确称取0.100 0 g丝氨酸标准品，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的丝氨酸标准溶液；采用逐级稀释来配置浓度分别为500、400、300、200、100、50、20、10、5 μg/mL的丝氨酸标准使用液；分别取100 μL丝氨酸标准使用液，加入4.00 mL OPA试剂（称取3.81 g十水四硼酸钠、100 mg SDS、8 mg OPA、88 mg二硫苏糖醇，用蒸馏水溶解并定容至100 mL），充分混匀，在室温下放置5 min，在340 nm下测定吸光值。

超声辅助酶解所得澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量的测定：取超声辅助酶解所得的澳洲坚果蛋白酶解液100 μL，按上述操作测定。对照组：将澳洲坚果蛋白用强酸充分水解[13]后，用上述操作测定其蛋白肽含量。超声辅助酶解的澳洲坚果蛋白水解度按下列公式计算：

式中：DH-超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度，%；A-超声辅助酶解的澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量，μg/g；B-充分水解的澳洲坚果蛋白中蛋白肽的含量，μg/g。

1.2.3 超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽单因素试验

（1）酶解时间对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取5.000 g澳洲坚果蛋白溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入4.0%的碱性蛋白酶，选超声功率为300 W，在50 ℃条件下恒温超声酶解不同时间，测定不同酶解时间（0、10、30、60、80、100、120、160 min）对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。

（2）超声功率对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取5.000 g澳洲坚果蛋白溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入4.0%的碱性蛋白酶，在不同超声功率条件下以50 ℃恒温酶解120 min，测定不同超声功率（0、100、200、300、400、500 W）对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。

（3）加酶量对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取5.000 g澳洲坚果蛋白溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入不同量的碱性蛋白酶，超声功率为400 W，在50 ℃条件下恒温酶解120 min，测定不同碱性蛋白酶添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。

（4）酶解初始pH值对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取5.000 g澳洲坚果蛋白溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH分别调节溶液pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，加入4.0%的碱性蛋白酶，超声功率为400 W，在50 ℃条件下恒温酶解120 min，测定不同pH值对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响。

1.2.4 超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽正交试验 在超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽单因素试验的基础上，分别选用超声酶解时间（A）、加酶量（B）、超声功率（C）、酶解初始pH值（D）4个因素，每个因素选择3个水平，以水解度为指标，选用L9（34）进行正交设计来优化最佳超声辅助酶解工艺条件。

1.2.5 超声辅助酶解所得澳洲坚果蛋白酶解液抗氧化活性的测定 ABTS自由基溶液的配制和抗氧化活性测定参照李瑞等[14]的方法，并作略微修改。

样品测定：取0.20 mL稀释后的澳洲坚果蛋白酶解液（优化条件），加入4.00 mL ABTS自由基工作液，室温下静置反应5 min，在734 nm下测定其吸光值，用无水乙醇调零，以蒸馏水作为空白对照组。按下列公式计算其清除率：

式中：SA-ABTS自由基清除率，%；A-超声辅助酶解所得澳洲坚果蛋白酶解液清除ABTS自由基的吸光值；Ao-对照组清除ABTS自由基的吸光值。

1.3 统计分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析，结果均表示为均值±标准偏差，采用origin 8.0软件作图，所有结果均进行3次重复试验。

2 结果与分析

2.1 酶解时间对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响

通过丝氨酸标准曲线的绘制，得出其线性回归方程为y=0.001 49x+0.000 01（x为丝氨酸含量ug/mL，y为吸光度，R2=0.999 9）。由图1可以看出，随着超声辅助酶解时间的增加，澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，在120 min达到最大值，之后趋于平缓。这可能是由于经过超声辅助酶解，使澳洲坚果蛋白的长链断开，结构变得松散，且碱性蛋白酶活性高，酶解产物的抑制作用小，从而在较短的时间内使其水解度有所提高；而120 min后随着超声辅助酶解时间的增加，酶解液中蛋白肽和游离氨基酸含量逐渐增加，其产生的抑制作用增大，碱性蛋白酶的活性因受到抑制而降低，且超过一定时间，超声波的机械和空穴等作用可能使澳洲坚果蛋白和酶的结合位点逐渐破坏，从而影响它们的酶解作用，使其水解度增加的趋势趋于平缓[15]，这与李杨等[16]利用超声辅助酶解制备红豆蛋白多肽、吴进菊等[15]利用超声辅助酶解法制备大豆蛋白抗氧化肽所得结果一致，即随着超声时间的增加，多肽或抗氧化钛水解度呈先升高后趋于平缓的变化趋势。综合各方面因素考虑，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白的适宜时间为120 min左右，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为20.08%。

2.2 超聲功率对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响

由图2可以看出，随着超声功率的增加，澳洲坚果蛋白的水解度呈先增加后降低的趋势。当超声功率为400 W时，蛋白质水解度达到最大（17.99%），继续增加超声功率，蛋白质水解度反而有所降低。这可能是因为超声作用会使蛋白质的酶作用位点更多地暴露出来，促进酶与蛋白质的酶解作用，导致蛋白质的水解度增加；当超声功率过大时，超声波产生的空化作用和热作用会破坏酶分子构象，使酶的活性降低甚至失活，从而导致蛋白质的水解度降低[15-17]。因此，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白的最适超声功率为400 W左右，在此条件下水解度达17.99%。

2.3 酶添加量对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响

由图3可以看出，随着碱性蛋白酶加酶量的增加，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，但水解度的增加幅度逐渐减小，当酶添加量增加到4.0%时，蛋白水解度达到16.75%；继续增加酶添加量，蛋白水解度增加不显著。这可能是由于随着碱性蛋白酶添加量的增加，增大了底物与酶的接触面积，从而增大了酶催化反应的速率，所以水解度增加较快；当碱性蛋白酶添加量达到最适值时，大部分蛋白质几乎达到了水解平衡，继续加大酶的添加量将不会对蛋白质的水解产生明显的效果[16]。因此，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白的最适加酶量为4.0%左右，在此条件下水解度达到16.75%。

2.4 酶解初始pH对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响

由图4可以看出，随着酶解初始pH值的增加，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，当酶解初始pH值增加到10.0时，蛋白水解度达到最大（17.04%）；继续增加酶解初始pH值，其水解度反而降低。这可能是由于澳洲坚果蛋白在pH6.0时溶解度较低，底物与酶接触不充分，而且蛋白酶都具有最适的pH值范围，只有在最适的pH值范围内才能发挥最好的酶解效果[18]。过高或过低的pH值均会导致酶空间结构的破坏，使酶活性降低，甚至失活，不利于酶解反应，导致其水解度降低[16]。而在pH8.0、9.0、10.0时，底物与酶接触比较充分，澳洲坚果蛋白的溶解度较大，水解度增加。因此，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白的适宜pH值为9.0左右，在此条件下的水解度达到17.04%。

2.5 超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽正交试验分析

根据以上单因素实验，以水解度为指标，选择酶解时间（A）、加酶量（B）、超声功率（C）和酶解初始pH值（D）4个因素进行L9（34）正交优化设计，确定超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽的最优工艺条件，正交试验设计见表2，正交试验结果见表3。

由表3可知，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽的工艺中各因素对蛋白水解度的影响次序为：酶添加量>酶解时间>酶解初始pH值>超声功率，酶添加量对其影响最为显著。最优的工艺条件为A3B3C1D3，即酶解时间120 min、加酶量5.0%、超声功率300 W、酶解液pH值10.0，在此条件下进行了3组平行验证试验，其水解度平均值为22.90%，优于正交试验的结果，并且该结果与郭刚军等[5]利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕蛋白制备的多肽水解度（22.83%和22.78%）相当，但其酶解时间为3.5 h。本研究方法明显缩短了酶解时间，说明超声辅助酶解更适宜澳洲坚果蛋白肽的制备。

2.6 超声辅助酶解所得澳洲坚果蛋白酶解液的抗氧化活性分析

清除ABTS自由基的能力可用来评价物质的抗氧化活性[19]。蛋白质通过酶解形成的多肽具有一定的抗氧化能力，对ABTS自由基等具有一定的清除能力[20]。图5显示了不同浓度的超声辅助酶解所得澳洲坚果蛋白酶解液以及100 μg/mL Vc和100 μg/mL BHT对ABTS自由基的清除能力。从图中可以看出，不同浓度澳洲坚果蛋白酶解液对ABTS自由基都有很强的清除能力，0.375%的澳洲坚果蛋白酶解液对ABTS自由基的清除能力为22.57%，且随着澳洲坚果蛋白酶解液浓度的增加，其清除能力也增强，6.0%澳洲坚果蛋白酶解液对ABTS自由基的清除能力达到92.59%，而100 μg/mL Vc和100 μg/mL BHT对ABTS自由基的清除能力分别仅为68.12%和66.17%。同时，范方宇等[1]研究碱性蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白所得酶解液的抗氧化活性，发现其清除羟基自由基和超氧自由基能力都较强。因此，超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备的蛋白肽具有较强的抗氧化活性，可作为一种具有抗氧化作用的食品添加剂应用于食品工业。

3 结论

本研究采用超声辅助酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽，并对其酶解液抗氧化活性进行评价。通过正交和验证试验发现其最优酶解条件为：酶解时间120 min、加酶量5.0%、超声功率300 W、酶解液pH值10.0，且各因素对超声辅助酶解澳洲坚果蛋白水解度的影响次序为：酶添加量>酶解时间>酶解初始pH值>超声功率，在此条件下所得澳洲坚果蛋白的水解度为22.90%，其6.0%的酶解液清除ABTS自由基的能力达92.59%，说明超声辅助酶解制备的澳洲坚果蛋白肽具有较强的抗氧化活性，可作为一种具有抗氧化作用的食品添加剂应用于食品工业。且本研究方法与郭刚军等[5]研究相比，明显缩短了酶解时间，但目前对于酶解液中蛋白肽的氨基酸组成、蛋白肽分子结构及其构效关系等都还未开展相关研究，后续将对这些方面进行深入研究，以期为澳洲坚果蛋白肽的开发和应用提供科学的理论基础。

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