曾巧英 凌秋平 胡斐 齐永文

摘 要 为了明确镁铝互作对甘蔗根系的影响，以甘蔗品种YT55为材料，通过简单钙溶液培养的方法，分析在不同浓度铝、镁处理下，甘蔗根的相对伸长率、抗氧化酶GPX、SOD和APX活性的变化。结果显示：50和100 μmol/L铝处理24 h，根系的伸长受到严重抑制，根的相对伸长率下降，但是随着胁迫时间的延长，铝毒对根伸长的抑制减弱；添加2 mmol/L的MgSO4到铝处理液中，3个时间点添加镁处理的根相对伸长率均高于没有添加镁的处理，镁缓解了铝毒对根伸长的抑制。铝胁迫24 h，铝处理的根系GPX、SOD和APX酶活性显著提高，但是随着处理时间的延长，在48 h表现为下降，72 h略微上升。铝胁迫24 h，镁处理与没有镁的处理相比，在50 μmol/L铝处理下的GPX酶活性，100 μmol/L铝处理下SOD和APX酶活性显著提高。到胁迫48 h，3个酶活性并未出现下降，高于没有添加镁的处理，72 h仍保持较高活性但与添加镁的处理没有显著差异。由此可见，甘蔗短时间内提高根系抗氧化酶活性在镁缓解甘蔗铝毒中起重要作用。

关键词 甘蔗；铝胁迫；镁；缓解；抗氧化酶活性

中图分类号 S566.1 文献标识码 A

Abstract The sugarcane variety， YT55， was used as experimental material to investigate the effects of magnesium （Mg）on ameliorating aluminum（Al）rhizotoxicity in sugarcane. The hydroponic experiment was carried out and the changes of relative root elongation rate and antioxidant enzyme activity were examined. The results revealed that root elongation was strongly inhibited in the presence of 50 and 100 μmol/L Al in a simple Ca solution at 24 h， and the inhibition was ameliorated over stress time. Significant amelioration of Al rhizotoxicity on root elongation was detected when the solutions contained 2 mmol/L Mg. After 24 h， 73% and 113% increases were detected for the relative root elongation rates at two levels of Al treatment adding Mg when compared with Al treatments， respectively. The activities of GPX， SOD and APX in sugarcane roots increased after 24 h. Then the activities of SOD， GPX and APX decreased at 48 h and slightly increased at 72 h. Application of 2 mmol/L Mg in Al solution resulted in increase of the GPX activity of 50 μmol/L Al treatment， SOD and APX activities of 100 μmol/L Al treatment after 24 h stresses. The activities of three antioxidant enzymes maintain higher level than those of Al treatment at 48 h and 72 h. These results revealed that increase of antioxidant enzyme activities play important role in alleviating Al toxicity by magnesium.

Key words Sugarcane； aluminum stress； magnesium； amelioration； antioxidant enzyme activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.012

甘蔗是我国重要的糖料作物，主产于我国广西、云南、广东等省（区）。这些省（区）的土壤为典型的酸性土壤，酸性土壤中铝的溶解性增强，进而对植物造成毒害[1]。对甘蔗的研究显示，在20 μmol/L铝处理24 h后， 甘蔗初生根的伸长受到抑制， 抑制率可达49.3%[2]。铝胁迫下，甘蔗株高和干物质量显著下降，根总长、根体积和根表面积显著减少，根系活力，P、K等养分的吸收受到限制，抗氧化酶活性发生变化[3-4]。因此南方酸性土壤的铝毒是限制甘蔗的生产的因素之一。

镁是植物中重要的必需元素，在植物光合作用和抗逆性方面起着重要作用。植物中，Al3+与Mg2+具有拮抗作用，Al3+可以抑制植物對Mg2+的吸收、转运及分布，导致植物缺镁，但是高浓度的镁也可以缓解铝对植物的毒害，上调镁转运基因，特别是高亲和的镁转运基因有助于缓解铝毒[5-7]。在对拟南芥的研究中发现，拟南芥对酸和铝的抗性与细胞内的镁含量和增加镁的吸收有关[5]。提高培养液镁的浓度可以缓解铝对大豆初生根伸长的抑制，而且在微摩尔级浓度就可以起作用[8-9]。但是在对甘蔗初生根的研究中发现1 mmol/L的镁对甘蔗初生根铝毒没有缓解作用[10]。本课题组发现继续提高镁浓度到2 mmol/L时可以缓解铝毒对甘蔗苗根的影响。本研究以甘蔗的苗根为研究对象，研究不同浓度铝和镁处理下的根系生长及抗氧化酶活性，探讨镁在缓解甘蔗铝毒中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

选取高产、抗逆性强的甘蔗品种YT55为材料，试验材料采自广州甘蔗糖业研究所实验田。

1.2 方法

1.2.1 植物培养与处理 选取生长一致的健康的种茎，将种茎砍成长短一致的单芽，在5%的多菌灵液体中浸泡5 min，在装有石英砂的育苗盘中进行育苗，出苗后，待幼苗长到具有4片完整的叶片时，选取生长一致的幼苗，将幼苗移到装有10 L简单钙溶液（含0.5 mmol/L CaCl2）的塑料培养盆中进行培养，每盆种植6苗。待到幼苗上的根系长出，去除种茎，继续培养2～3 d，幼苗上的苗根长到6～7 cm时开始试验，首先选取10条生长一致的苗根，在离根尖5 cm处用圆珠笔做标记，然后移入加不同铝和镁处理的培养液中进行处理，设5个处理：T0（CK，含0.5 mmol/L CaCl2的简单钙溶液）、T1（50 μmol/L的AlCl3）、T2（100 μmol/L的AlCl3）、T3（50 μmol/L的AlCl3+2 mmol/L的MgSO4）和T4（100 μmol/L的AlCl3+2 mmol/L的MgSO4），pH5.0，以上处理均在简单的钙溶液中加入相应浓度的Al和Mg。在处理的24、48和72 h测根长，并取样测定抗氧化酶活性。

1.2.2 测定指标与方法 在处理24、48和72 h，测定各处理从根尖到标记处的根的长度，计算根系的绝对伸长量，再按照以下公式计算根的相对伸长率：根的相对伸长率=处理的根绝对伸长量/对照的绝对伸长量。

同时，每个处理取5条完整的根混合测根系的抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、GPX（愈创木酚过氧化物酶）和APX（抗坏血酸专一性过氧化物酶）的活性，设3次重复。抗氧化酶的提取及活性测定方法参照李忠光等[11]的方法，并做修改。抗氧化酶提取液为50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，内含1 mmol/L EDTA，1 mmol/L ASA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L GSH，5 mmol/L MgCl2和20%甘油），样品用液氮研磨后，准确称取约0.2 g样品，加入2 mL的提取液，在4 ℃下12 000 r/min离心30 min，取上清液分装，用液氮冷冻后保存在-80 ℃，用于酶活性的测定。

GPX酶活性测定，反应混合液为50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.0，内含0.1 mmol/L EDTA，10 mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2。测定时，反应混合液先在25 ℃水浴中预热。取反应混合液2.975 mL，加入酶液25 μL，终体积为3 mL，混匀后启动反应。每30 s读取1次OD470增加值。取3 min反应时间来计算酶活性。以单位重量OD470每分钟增加值计算酶活性。

SOD酶活性的测定，反应混合液为50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L NBT，13.37 mmol/L蛋氨酸。測定时，反应混合液和0.1 mmol/L核黄素溶液（用含0.1 mmol/L EDTA的pH为7.8 的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液配制）预先于25 ℃水浴中预热。取反应混合液2.85 mL（最大光还原管为2.90 mL，不加酶液），加入酶液50 μL，再加入核黄素溶液100 μL，终体积为3 mL，混匀后置于120 W（30 W/管共4管）日光灯下20 cm进行光氧化还原反应30 min，每个样品设4个管，其中1个为最大反应管（以缓冲液代替酶液），1个为空白（用不照光的1个反应管），另外2个为反应管。反应结束后，在无灯光照射的室内快速测定OD560。以达到最大反应管的吸光值的一半的酶量为1个酶活力单位，计算单位重量的SOD酶活性

APX酶活性的测定，反应混合液为50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.0，内含0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L H2O2。测定时，反应混合液和30 mmol/L ASA预先在25 ℃水浴中预热。取反应混合液2.85 mL，加入酶液100 μL，摇匀并调零，加入30 mmol/L 的ASA 50 μL（终浓度为0.5 mmol/L）， 终体积为3 mL，摇匀启动反应，每隔10 s读出OD290的减少值。以每分钟氧化 1 mmol ASA的酶量为1个酶活力单位，消光系数2.8 mM-1·cm-1。

1.3 数据统计分析

所有试验数据的方差分析均采用DPS7.05软件进行，以LSD法进行多重比较（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 镁铝互作对铝胁迫下根系伸长率的影响

铝胁迫对甘蔗的毒害作用首先表现为抑制了甘蔗根的伸长。如图1所示，50和100 μmol/L铝处理（T1和T2处理）甘蔗根系24 h后，甘蔗根系的伸长量显著下降，根的相对伸长率分别下降到29.21%和16.85%。随着胁迫时间的延长，甘蔗根系的伸长受到的抑制有所缓解，根的相对伸长率上升，72 h后分别为达到了49.03%和43.79%，是胁迫24 h的1.68和2.60倍。在添加2 mg/L的镁后，铝胁迫对根系的伸长的抑制显著降低。处理24 h后，添加镁的2个铝处理（T3和T4）根的相对伸长率分别是没有加镁处理（T1和T2）的1.73和2.13倍，显著高于没有添加镁的铝处理；到48 h后，镁对高浓度铝胁迫的缓解作用减弱，T2处理和T4处理的根相对伸长率没有显著差异。到72 h后这种缓解继续减弱，添加镁的量处理（T3和T4）根的相对伸长率分别是没有加镁处理（T1和T2）的1.43和1.06倍。3个时间点均以T3处理显著高于其他处理，由此可见镁可以缓解铝毒对甘蔗根系的抑制，但是在高浓度铝胁迫下，镁的缓解作用减弱。

2.2 镁铝互作对铝胁迫下根系抗氧化酶活性的影响

铝对植物的伤害之一是造成体内活性氧的积累，引起细胞内的氧化胁迫，而抗氧化酶在清除活性氧方面起重要作用[2]。在铝胁迫24 h后甘蔗根的GPX酶活性显著增加，T1和T2处理的酶活性分别比对照T0提高了27.27%和57.14%；在铝处理溶液中添加镁后，GPX酶活性发生变化，其中T3处理的酶活性较T1提高了20.07%，T4处理的低于T2处理，但是这2个处理都显著高于T0。处理48 h后，铝胁迫的甘蔗根系GPX酶活性下降，其中T1比T0下降了28.57%，显著低于T0处理，而T2与T0没有显著差异；在添加镁后，T3处理的GPX酶活性比T1处理的提高了44.96%，而T4的GPX酶活性仍低于T2；到处理的72 h，T1和T2处理甘蔗根系GPX酶活性提高，但与T0没有显著差异，同时加镁处理与不加镁处理的GPX酶活性也没有显著差异（表1）。

甘蔗根系的SOD酶活性在铝胁迫下发生改变。铝胁迫24 h，T1和T2处理的SOD酶活性分别比T0处理提高了20.21%和66.68%，其中T2处理显著高于T0处理；在铝处理中添加镁后，T3和T4处理的SOD酶活性分别比T1和T2提高了10.39%和23.49%，其中T4显著高于T2的处理。铝胁迫48 h，T1处理的甘蔗根系SOD酶的活性显著下降，与T0相比下降了23.94%，而T2处理的SOD酶活性则提高了6.69%，但与T0没有显著差异；添加镁后，T3和T4的SOD酶活性都高于没有添加镁的处理T1和T2，其中T3处理的SOD酶活性显著提高了55.91%，为5个处理中最高。铝胁迫72 h，T1和T2的甘蔗根系SOD酶活性提高，与对照没有显著差异；添加镁的T3和T4处理的SOD酶活性高于T1和T2处理，但是与对照都也没有显著差异（表2）。

铝胁迫下，APX酶活性的变化与SOD酶活性的变化相似。在铝处理24 h，铝处理的APX酶活性提高，其中T2显著提高了72.18%，同样添加镁后，T3和T4处理的APX酶活性高于T1和T2处理，T4处理的APX酶活性提高幅度最高，比T2处理提高了34.50%，是对照的2.31倍，为5个处理中APX酶活性最高。铝胁迫48 h，T1处理的APX酶活性较T0显著下降，而添加镁的T3与T4处理APX酶活性比T1和T2高，但仍低于T0，与T0没有显著差异。铝处理72 h后，各处理间的APX酶活性没有显著差异（表3）。

3 讨论

3.1 镁铝互作有效降低铝对甘蔗根系伸长的抑制

根系是吸收土壤铝的主要器官，也是最先受到铝的毒害影响的部位。研究显示，铝胁迫2 h后就可以在根尖的表皮和外皮层检测到铝的存在[12]。绝大部分铝都结合在细胞壁，改变根尖细胞壁的纤维素、半纤维素等组分，降低细胞壁的伸展性，导致根的伸长受到抑制[13]，因此根的相对伸长率是衡量植物铝毒害的主要指标。在对甘蔗铝毒害的研究中发现，铝胁迫12 h，根的伸长量显著低于对照，24 h后根的相对伸长率继续下降[2]。本研究的结果，同样显示在铝胁迫24 h后根的伸长受到严重抑制，表现为根的相对伸长率下降，但由于本研究所采用的铝浓度较高，根的相对伸长率低于之前的研究[2]。另外，本研究还发现铝胁迫48和72 h，根的伸长受铝胁迫的抑制减弱，根的相对伸长率逐渐上升，这种现象的出現可能与甘蔗在铝胁迫下的根系分泌物有关。铝胁迫下植物根系分泌有机酸、粘液等已经被认为是植物对抗铝毒的主要机制之一[14]。在甘蔗的研究中发现，铝胁迫24 h，甘蔗根尖分泌的酒石酸量增加[10]。在试验的开展过程中，笔者也同样观察到铝胁迫后甘蔗根尖的粘液增加（数据没有包含在本文中），这些根系分泌物的存在一定程度上可以缓解铝对根系毒害。

植物根系对镁的吸收与铝有拮抗作用，土壤中铝离子的增加会减少镁的吸收，但是同样镁的增加也可以缓解铝对植物的抑制[15]，这种作用在水稻中过量表达镁转运蛋白可以提高植物对铝的抗性的研究中得到了验证[16]。但是镁对植物铝毒的缓解与植物类型及处理的浓度有关。谭贵良[10]的研究中，添加0.4和1 mmol/L的镁元素后没有观察到镁对铝胁迫的缓解作用，而本研究将添加的镁浓度提高到2 mmol/L时，甘蔗根系伸长受到的抑制显著降低，表现出根的相对伸长率比没有添加镁的处理显著提高，这说明高浓度的镁对甘蔗根系铝毒的缓解具有一定作用。这种缓解可能与高浓度的镁与铝产生的拮抗作用及根系的分泌物有关。在对甘蔗近缘的高粱的研究中发现，将Mg的浓度增加到2.5和7.5 mmol/L的时候不仅可以降低铝诱导的缺镁，而且可以降低根系铝的含量，缓解铝对根系的破坏[15]。大豆铝毒的研究中发现，添加镁可以有效缓解铝对根系伸长的抑制，并且根系中铝含量显著下降，根尖分泌的柠檬酸的速度增加[17-18]。镁可以通过保持细胞膜上H+-ATPase活性来提高ricebean铝诱导的苹果酸的分泌[19]。

3.2 抗氧化酶活性在镁缓解铝毒中的作用

铝胁迫能诱导植物体内产生活性氧（ROS），如超氧自由基、单线态氧、过氧化氢等，打破植物体内活性氧的平衡，造成植物的氧化胁迫[20]。植物体内的抗氧化酶，如SOD、POD、CAT、APX等酶在消除活性氧的代谢活动中起重要的作用，铝胁迫下，植物的抗氧化酶活性发生改变，以适应铝毒造成的氧化胁迫[20]。在甘蔗的铝胁迫的研究中发现，在胁迫24 h后，根系的SOD和POD酶活性增强[2]。本研究与之前的研究吻合，在铝胁迫24 h，根系的SOD、GPX和APX酶活性都显著提高，有利于甘蔗对抗铝胁迫引起的氧化胁迫。随着时间的延长，这3个酶的活性都出现下降，随后上升但与对照的差异不明显，这个酶活性的变化过程与根伸长受抑制程度随时间的延长降低相吻合，这在一定程度上表明，抗氧化酶在甘蔗对抗铝毒中起重要的作用。在对水稻的研究中发现，铝处理过程中添加镁元素后，缓解铝对根系的毒害，根系的活性氧、膜脂过氧化降低，并且抑制了铝诱导的SOD， GPX 和APX 酶活性的增加[21]。本研究的结果与之相反，镁存在的情况下，3个时间点甘蔗根系的抗氧化酶活性均要高于相应浓度的铝胁迫的抗氧化酶活性，这种差异与两个研究所采用个植物及处理时间不同有关。在胁迫24 h抗氧化酶活性的增加是有利于植物对活性氧的清除，降低由于铝胁迫引起的过氧化胁迫。由此可见短时间内提高根系的抗氧化酶活性是铝镁互作缓解甘蔗铝毒的机制之一。

综上所述，铝胁迫显著抑制了甘蔗根系的伸长，导致根的相对伸长率下降。随着胁迫时间的延长，甘蔗根系的伸长受抑制程度减弱。镁的增加有效缓解了铝对甘蔗根伸长的抑制，根系相对伸长率显著高于没有加镁的处理。在铝胁迫24 h，甘蔗的抗氧化酶SOD、GPX和APX酶活性显著增加，但是随后下降，添加镁的处理这3个酶活性高于没有添加镁的处理，并且在3个时间点都保持较高的水平，由此可见提高甘蔗根系的抗氧化酶活性有可能是甘蔗镁铝互作缓解甘蔗铝毒的重要原因之一。

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