彭波 孙艳芳 庞瑞华 孔冬艳 宋晓华 李慧龙 李金涛 周棋赢 段斌 柳琳 宋世枝

摘要：水稻（Oryza sativa L.）种子中的蛋白质含量是决定稻米营养品质的一个关键因素，增加稻米中的蛋白质含量对其品质改良具有十分重要的意义。文章综述了水稻种子蛋白质的组成、蛋白质含量的数量性状位点（Quantitative trait locus， QTL）定位、相关基因分离克隆及其基因表达调控等方面的研究进展，针对目前对水稻种子蛋白质含量相关基因功能和遗传调控规律尚不清楚的问题，提出采用基因聚合或利用分子标记辅助选择育种提高水稻种子蛋白质含量的策略，为水稻和其他重要作物品质的遗传改良提供参考和借鉴。

关键词： 水稻；种子；蛋白质含量；QTL定位；基因克隆；遗传改良

中图分类号： S330.25 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0401-07

0 引言

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，世界上有50%、我国有近2/3的人口以稻米为主食（Tian et al.，2009）。以提高水稻产量为育种目标曾导致市场上很多稻米品质欠佳，如今，随着世界人口的持续增长和生活水平的不断提高，人们对稻米品质的要求越来越高，科学家也越来越重视对稻米品质的研究（Fitzgerald et al.，2008，2009；Chen et al.，2012；Peng et al.，2014a）。然而水稻品质性状极其复杂，受到许多基因的控制与调节，且易受到外界环境因素的影响（Chen et al.，2012；彭波等，2016）。一般认为水稻品质由营养品质、外观品质、加工品质、蒸煮和食味品质等组成（Zhang，2007；Pandey et al.，2012；Bhullar and Gruissem，2013；Peng et al.，2014b）。不同地区对水稻各品质性状的关注有所不同，如远东地区喜欢黏性且偏软的稻米，而印度优先选择非黏性的稻米，发达国家则要求稻米具有良好的蒸煮和食味品质，许多发展中国家和地区以稻米为唯一营养来源，营养品质是最重要也是最受关注的性状（Chen et al.，2012）。水稻的营养品质主要决定于水稻种子中蛋白质、氨基酸及部分维生素含量的高低，而蛋白质含量是水稻最重要的营养品质之一，水稻是人们从食物中获取蛋白质的主要来源（Peng et al.，2014a；Raubenheimer and Simpson，2016）。同时，稻米中蛋白质的氨基酸组成比较均衡、限制性氨基酸含量较高，容易被人体消化吸收，在我国颁布的农业行业标准《食用稻品种品质》中，稻米的蛋白质含量被列为检测项目之一（鄢宝等，2012）。

Fitzgerald等（2009）预测，到2050年世界人口将达到或超过90亿，人们对高品质作物的需求预计在未来相当长的一段时间内还将不断增加。因此，在未来的水稻育种过程中提高水稻籽粒的蛋白质含量并调节其比例，进而提升稻米的营养品质对水稻育种具有重要意义。水稻功能基因组学在全球的研究已取得重要进展并不断快速发展，主要表现在各种技术和资源平台的建设为高通量基因或基因型鉴定打下了基础；已开展针对各种农艺性状和生物过程功能基因组学的研究和分析；分离、克隆和鉴定功能基因并已应用于水稻育种（Jiang et al.，2012）。同时，水稻品质方面的遗传改良也取得了巨大进步（Chen et al.，2012；Bhullar and Gruissem，2013），如发现水稻种子蛋白质含量不仅是决定营养品质的重要指标，还对稻米的外观品质、加工品质和食用品质有一定影响（Cao et al.，2013）。因此，阐明水稻种子蛋白质含量的遗传基础对水稻品质改良具有重要意义。本文综述了近期水稻种子蛋白质含量在数量性状位点（Quantitative trait locus，QTL）定位、相关基因克隆和调控方面的新进展，并提出了遗传改良策略，以期为水稻蛋白质含量的深入研究、稻米营养品质的改良和优质水稻新品种的培育提供参考。

1 水稻种子蛋白质的组成及含量

水稻中的蛋白质种类繁多，按照其功能可分为储藏蛋白（水稻种子储藏物质的蛋白，同时具有保护功能）、结构蛋白（维持水稻种子细胞正常代谢的蛋白）和保护蛋白（Shewry and Halford，2002）。通常水稻种子中的结构蛋白种类较多，但每种结构蛋白的含量极少（田爽和王晓萍，2014）。与其他种类蛋白相比，储藏蛋白含量较高，通常所指的水稻蛋白质，主要是指储藏蛋白。水稻籽粒干重的90%以上是由储藏淀粉和蛋白质组成（Tian et al.，2009；Wang et al.，2009a），水稻胚中的蛋白质含量最高，变异范围为16.8%～24.1%；糙米和精米中的蛋白质含量变异范围分别为5.1%～

15.4%和4.5%～14.3%（Juliao，1972）。根据水稻种子储藏蛋白的溶解情况和不同的分离提取方法可将储藏蛋白分为四大类：可溶解于水的蛋白质称为清蛋白，溶于稀盐溶液的蛋白质称为球蛋白，能溶解于醇和水混合物的蛋白质称为醇溶蛋白，可溶解于稀酸或稀碱的蛋白质称为谷蛋白（焦爱霞等，2008；He et al.，2013）。水稻胚乳中的储藏蛋白主要是谷蛋白和醇溶蛋白，其中，谷蛋白是最容易消化的蛋白质，约占胚乳中蛋白质含量的80%（Wang et al.，2009a），醇溶性蛋白含量約占20%（Kawakatsu et al.，2010；He et al.，2013）。清蛋白和球蛋白含量分别约占稻米总蛋白质含量的5%和10%（Shewry and Halford，2002；Peng et al.，2014a）。总体上，水稻籽粒的蛋白质含量为4.3%～

19.3%（Shewry，2007；Lu et al.，2009；周丽慧等，2009； Ye et al.，2010），为全世界人口提供约15%的蛋白质来源（He et al.，2013）。水稻胚乳蛋白质含量和必需氨基酸含量均衡是决定稻米营养质量的两个最重要因素（Duan and Sun，2005；Peng et al.，2014a），稻米中的氨基酸含量相对其他作物（如小麦、玉米等）而言比较均衡，因此，增加水稻种子的蛋白质含量对提高稻米的营养品质具有重要意义。

2 水稻种子蛋白质含量的QTL定位

水稻种子蛋白质含量是典型的数量性状（Shewry， 2007），容易受环境条件的影响。目前，关于水稻种子蛋白质含量的研究报道很多，其中大部分为蛋白质含量定位，对蛋白质含量功能方面基本上是利用突变体进行研究（Wang et al.，2010）。不同研究小组利用不同的遗传作图群体针对水稻种子蛋白质含量QTL定位进行了探讨（Aluko et al.，2004；钟明等，2007；Wang et al.，2007；Kepiro et al.，2008；Mahmoud et al.，2008；张涛等，2009；Lou et al.，2009；Yu et al.，2009；Ye et al.，2010；Liu et al.，2011；鄢宝等，2012；杨亚春等，2012）。

Tan等（2001）利用1个重组自交系（Recombinant inbred lines，RILs）群体在水稻第6和第7染色体上分别定位到1个控制稻米蛋白质含量的主效QTL，其中第6染色体上的QTL在Waxy基因附近。吴长明等（2003）利用Asominori/IR24来源于籼稻和粳稻的RILs群体在第1染色体定位到1个贡献率为17.2%的稻米蛋白质含量控制QTL，在第7染色体定位到的2個QTLs贡献率均大于10.0%。Aluko等（2004）利用来源于BC3F1（O. sativa×O. glaberrima）的1个单双倍群体（Doubled haploid line，DH）在第1、2、6和11染色体上分别检测到1个控制蛋白质含量的QTL，其中在第6染色体上扫描得到的QTL与Tan等（2001）定位的结果是同1个位点。李晨等（2006）利用1个BC1群体共定位到6个控制糙米蛋白质含量的QTLs，且定位到1个主效的QTL qCP12，这个QTL很可能与谷蛋白基因Glu1紧密连锁。于永红等（2006）利用协青早B/密阳46的RILs群体共定位到5个控制蛋白质含量的QTLs分别位于第3、4、5、6和10染色体上，总的贡献率达42.8%。钟明等（2007）利用RILs群体（来源于珍汕97/南洋占）对糙米蛋白质和精米蛋白质含量分别进行QTL定位研究，共检测到4个控制糙米蛋白质含量的QTLs和2个控制精米蛋白质含量的QTLs，其中控制精米蛋白质含量的2个QTLs与控制糙米蛋白质含量的QTLs完全重合。同样利用RILs群体，Kepiro等（2008）在糙米中定位到2个QTLs，在精米中定位到3个QTLs，其中2个位于第1、4染色体上的QTLs同时控制糙米和精米的蛋白质含量。Mahmoud等（2008）利用F2分离群体（Oryza nivara/IR64）发现来源于野生稻的部分片段可显著提高杂交后代的蛋白质含量。Zhang（2007）用RILs群体及2套染色体片段代换系（Single chromosome segment substitution line，SCSS）的定位结果表明，控制蛋白质含量的QTL主要分布在第2、7、8和12染色体上，在第2、7和12染色体上分别发现3个控制粗蛋白质含量的QTLs，而位于第12条染色体的QTL不但影响谷蛋白含量，而且控制糙米蛋白质含量。Lou等（2009）利用川7和南洋占构建的RILs群体共检测到2个控制蛋白质含量的QTL，其共同解释的表型变异仅有7.2%。张涛等（2009）在第3、6、7、8和11染色体上共检测到6个控制糙米蛋白质含量的QTLs，联合贡献率达61.07%。Yu等（2009）利用RILs群体（Xieqingzao B×Milyang 46）分别在第3、4、5、6和10染色体上定位到控制籽粒蛋白质含量的QTLs，其中在第6染色体短臂上Waxy基因附近的qPC-6效应达19.3%。Ye等（2010）利用SCSS在4个地点两年的数据检测到至少15个与蛋白质含量相关的片段，其中在8种环境条件下均可检测到第8染色体上的SCSS-48。同样利用SCSS（Asominori×IR24）群体，Liu等（2011）分别在第1、2、3、6、8和11染色体上定位到蛋白质含量的QTLs。黄覃等（2012）利用明恢63和优质泰国香米KDML105的重组自交系群体也定位到控制糙米蛋白质含量的QTLs，但效应较小。杨亚春等（2012）在两种环境下从糙米和精米中共检测到9个控制蛋白质含量的QTLs。鄢宝等（2012）利用两年的田间数据在糙米中共定位到3个控制蛋白质含量的QTLs，且发现有16对上位性互作位点，位于第8染色体上的qbpc8在两年中均被检测到。

以上研究在水稻的12条染色体上均定位到与稻米蛋白质含量相关的QTLs，尽管不同研究小组所使用的亲本、定位群体、环境和定位方法等存在或多或少的差异，但有些QTLs在不同的研究结果中均能检测得到。例如位于第6染色体Waxy基因附近的区域在不同研究结构中均检测到该位点影响稻米的蛋白质含量（Tan et al，2001；Aluko et al.，2004；于永红等，2006；Yu et al.，2009）；位于第10染色体上主要影响谷蛋白和醇溶性蛋白的区域在不同研究中也反复被检测到（Yu et al.，2009）。钟明等（2007）利用RILs群体（来源于珍汕97/南洋占）对糙米和精米蛋白质含量进行QTL定位研究，发现第1染色体RM472～RM104区间有控制精米蛋白质含量的2个QTLs与控制糙米蛋白质含量的QTLs完全重合，遗传效应均在20.0%以上。随后笔者针对此区间建立遗传群体进一步验证该QTLs的真实性，并利用图位克隆策略分离到1个控制稻米蛋白质含量的主效QTL基因OsAAP6（Peng et al.，2014a）。因此，针对遗传效应较大的QTLs，建立相应的遗传群体进行精细定位，最后利用图位克隆策略分离目标基因切实可行。

3 水稻种子蛋白质相关基因的克隆

水稻种子储藏蛋白的编码基因通常由一个复杂的多基因家族或单个基因的多个拷贝控制，且同类储藏蛋白是具有高度多态性的多肽混合物（Duan and Sun，2005）。目前，影响水稻储藏蛋白的基因多数是通过各种水稻突变体进行分离克隆而获得（Takemoto et al.，2002；She et al.，2010；Wang et al.，2010；Ren et al.，2014）。

在水稻基因组中至少有15个基因编码谷蛋白（Kawakatsu et al.，2008；Xu and Messing，2009；Kawa-

katsu et al.，2010）。根据编码谷蛋白基因氨基酸序列的形似性，可将谷蛋白分为四种类型：A型谷蛋白（Glutelin type-A，GluA）、B型谷蛋白（Glutelin type-B，GluB）、C型谷蛋白（Glutelin type-C，GluC）和D型谷蛋白（Glutelin type-D，GluD）。其中，A型谷蛋白包括GluA-1、GluA-2、GluA-3和GluA-4，B型谷蛋白包括GluB-1、GluB-2、GluB-3、GluB-4、GluB-5和GluB-6（Takaiwa et al.，1991；Kawakatsu et al.，2008）；GluA-1和GluA-4基因均位于第1染色体上，GluA-4基因是一个假基因；GluA-3基因位于第3染色体上；GluA-2基因位于第10染色体上；其余基因均分布在第2染色体上。对C型谷蛋白仅鉴定到2个基因，D型谷蛋白仅鉴定到1个基因（Takaiwa et al.，1991；Kawakatsu et al.，2008；Kawakatsu et al.，2010；Chen et al.，2012）。水稻种子储藏蛋白的合成及合成后的加工转运过程极其复杂，且不同储藏蛋白的加工运输方式和途径均有所区别（Jolliffe et al.，2005；Vitale and Hinz，2005；Ren et al.，2014）。對水稻种子储藏蛋白合成后加工转运过程的了解目前也仅局限于对突变体研究，至少已有11个与谷蛋白合成转运相关的突变体获得报道，如esp2、glup1（esp5）、glup2（esp6）、glup3（esp7）、glup4（esp8）、Glup5、glup6、glup7、Osvpe1、OsRab5a和gpa3（Wang et al.，2009b；Wang et al.，2010；Ren et al.，2014）。这些突变体中，只有gpa3、Osvpe1和OsRab5a基因已被成功克隆，其中Osvpe1被克隆是由于其在第269个氨基酸残基发生突变使半胱氨酸突变为甘氨酸，进而导致谷蛋白前体不能正常加工转运，最终在成熟突变体中蛋白变小（Wang et al.，2009b）。Wang等（2010）通过检测谷蛋白前体存在突变的水稻植株，发现1个参与囊泡转运谷蛋白前体的突变gpa1（Glutelin precursor accumulation），进一步研究表明gpa1是编码1个小GTPase的蛋白，该蛋白在水稻胚乳灌浆过程中可能参与种子储藏蛋白在内膜系统细胞间的转运及最终转运到蛋白体Ⅱ。gpa3突变体中呈现粉质的胚乳，谷蛋白前体在水稻种子胚乳中得到大量积累（Ren et al.，2014）。

在水稻基因组中至少有34个基因编码醇溶性蛋白（Kawakatsu et al.，2008；Xu and Messing，2009），根据聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测醇溶蛋白的分子量，将其分为三种类型：10 kD-醇溶蛋白（10 kD-prolamin）、13 kD-醇溶蛋白（13 kD-prolamin）和16 kD-醇溶蛋白（16 kD-prolamin）。其中，13 kD-醇溶蛋白占总醇溶蛋白的比例较大，根据其半胱氨酸含量可分为3个亚类（13 kD-prolamin亚类Ⅰ、13 kD-prolamin亚类Ⅱ和13 kD-prolamin亚类Ⅲ）。水稻胚乳中的醇溶蛋白是由多基因家族编码，且每种单倍型均有80～100个重复（Wen et al.，1993；Mitsukawa et al.，1999），所以一直以来对水稻醇溶蛋白的研究进展缓慢。在水稻醇溶蛋白的80～100个编码基因中，10 kDa-醇溶蛋白基因和3个13 kDa-醇溶蛋白基因的表达模式与谷蛋白基因的表达模式非常相似，但13 kDa-醇溶蛋白基因亚家族中的另外2个基因自受精后其表达量就不断缓慢增加直至种子成熟（Duan and Sun，2005）；还有2个16 kDa-醇溶蛋白基因亚家族中的基因自受精后8 d其基因的表达量开始逐渐积累直至受精后的26～28 d（Mitsukawa et al.，1999）。这些研究结果表明，大部分控制种子储藏蛋白的基因表达模式相似，可能在种子蛋白积累过程中存在功能冗余现象。

目前，对于清蛋白和球蛋白的研究比较有限，因为它们在水稻种子中的含量较少，主要积累在胚和胚乳的糊粉层中，有些球蛋白是在蛋白体Ⅱ中不断积累。已经报道的清蛋白基因仅有RA16和RA17，二者均属于2S清蛋白家族，序列相似性约80%（Adachi et al.，1993）。对水稻球蛋白相关基因克隆的报道极少，仅有Glb基因被成功分离克隆，对应GenBank中的登录号为D50643（Nakase et al.，1996）。

利用水稻自然群体已在第1染色体的长臂上分离克隆到第1个控制稻米蛋白质含量的主效QTL基因OsAAP6（Peng et al.，2014a），该基因是一个正调控因子：OsAAP6基因上调表达能增加稻米中谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白4种种子储藏蛋白含量，进而引起总蛋白质含量升高；反之4种种子储藏蛋白和总蛋白质含量均降低。尽管目前已克隆到控制水稻种子蛋白相关的基因，但对这些基因在水稻种子中定量调控的机制还不清楚。

4 水稻种子储藏蛋白基因的调控

水稻种子储藏蛋白基因在籽粒灌浆期均有强烈表达（Duan et al.，2005），意味着与种子储藏蛋白相关的基因可能有相似的调控机制。目前，在水稻种子储藏蛋白基因的5'启动子中已鉴定到一些普遍存在的顺式调控原件，这些调控原件不仅在水稻中存在，在别的作物中也有发现（Chen et al.，2012）。比较不同作物醇溶蛋白基因的启动子序列发现，在翻译起始位点上游-300 bp的一段序列比较保守，称为双因子胚乳盒（Bifactorial endosperm box，BE-box），BE-box由1个醇溶谷蛋白盒模体（Prolamine box class endosperm motif）和1个邻近的类似GCN4的模体（GCN4-like motif）组成。醇溶蛋白盒（Prolamin box）和GCN4在小麦、玉米、高粱、大麦、黑麦和燕麦的种子储藏蛋白中均存在（Marzabal et al.，1998；Norre et al.，2002）。GCN4、ACGT盒、醇溶蛋白盒和AACA盒在水稻的GluA、GluB和GluD亚家族基因中均能找到对应的顺式作用原件（Kawakatsu et al.，2008；Qu et al.，2008），但这些顺式作用原件在GluC启动子区找不到对应的序列，意味着GluC的表达调控可能有所不同（Qu et al.，2008）。在水稻的醇溶蛋白基因中也发现存在醇溶蛋白盒及类似GCN4的模体（Qu and Takaiwa，2004；Chen et al.，2012）。

在水稻中发现能结合ACGT元件且能够激活检测报告基因瞬时表达的第1个蛋白质是碱性亮氨酸拉链蛋白（bZIP蛋白）家族的一个蛋白质，后来命名为RITA-1，在α-球蛋白启动子区域发现了另外一个bZIP蛋白（后来命名为REB）可与GCCACGT（c/a）AG序列进行特异互作（Nakase et al.，1997）。bZIP蛋白家族中的另外5个反式作用因子RISBZ1、RISBZ2、RISBZ3、RISBZ4和RISBZ5的结合功能后来也通过来源于水稻种子的cDNA文库得到鉴定，并发现这些作用因子能与水稻GluB-1启动子上的GCN4-Box结合，但仅RISBZ1能反式激活用1个截短启动子连接五聚体的GCN4-box，进而驱动报道基因的表达（Kawakatsu et al.，2008）。醇溶蛋白盒结合因子（Prolamin box-binding factor，RPBF）能识别GluB-1启动子的AAAG/CTTT模体，用水稻种子储藏基因启动子驱动GUS基因的表达试验结果显示，RISBZ1和RPBF因子可反式激活GUS基因的瞬时表达，如GluA-1、GluA-2、GluA-3、GluB-1、GluD-1、10 kDa-醇溶蛋白基因、13 kDa-醇溶蛋白基因、16 kDa-醇溶蛋白基因和α-球蛋白基因的启动子等（Chen et al.，2012）。在瞬时表达分析中发现，反式作用因子RISBZ1和RPBF存在协同促进作用（Yamamoto et al.，2006；Kawakatsu et al.，2008），但只有在水稻的转基因品种中表达才显示目标基因表达受到影响且改变蛋白质的积累（Kawakatsu et al.，2009；Chen et al.，2012）。

在成熟的水稻种子中，虽然谷蛋白比醇溶蛋白在摩尔数上略多，但谷蛋白的重量约为醇溶蛋白的4倍。研究其对应基因的表达水平发现，在受精后5 d表达水平基本上未存在差异，但自种子灌浆到开花后10 d谷蛋白基因的表达量远高于醇溶蛋白（Duan et al.，2005；Chen et al.，2012），说明水稻谷蛋白和醇溶蛋白多基因家族具有不同转录方式和转录后的调控方式。水稻胚乳中的内质网对蛋白质合成、加工、储藏及其转运均是极重要的内膜组织，如Esp2是一个类似于蛋白二硫键异构酶的基因，不对称分布于光面内质网的内部，在Esp2突变体中谷蛋白前体得到积累，而谷蛋白的酸性亚基和碱性亚基明显减少（Satoh-Cruz et al.，2010）。也有研究表明，水稻的醇溶蛋白和内质网分子伴侣结合蛋白（ER chaperone binding protein）对于从内质网上形成蛋白体非常重要（Saito et al.，2009）。如果结合蛋白1（Binding protein 1，BiP1）基因被抑制表达或过量表达，则引起严重的表型：种子中的储藏蛋白和淀粉含量均明显降低，且储藏蛋白的组成发生改变（Kawakatsu et al.，2010；Wakasa et al.，2011）。Satoh-Cruz等（2010）研究发现，囊泡中一些酶类对谷蛋白前体的处理加工对于正常蛋白囊泡的结构和储藏蛋白的分拣运输起着重要作用。因此，水稻种子储藏蛋白相关的基因具有不同转录和转录后的调控方式，可能参与水稻胚乳中内质网对蛋白质的合成、加工、转运及储藏过程。

5 展望

水稻種子蛋白质含量是典型的数量性状，遗传基础比较复杂，且易受环境因素影响（Chen et al.，2012）。过去相当长的时期内，测定蛋白质含量的经典方法是凯式定氮法，但该方法的最大缺陷是耗时费力，且许多人为因素导致测量结果重复性不佳，不利于大规模分析测定种子中的蛋白质含量。近红外分析仪的出现给蛋白质含量的高通量检测分析带来了极大便利，于是大量与水稻种子蛋白质含量相关的QTL相继被发掘，甚至得到成功的分离与克隆（Peng et al.，2014a）。同时，利用大量的突变体材料，一批与控制水稻种子蛋白质含量相关的基因也不断被克隆（She et al.，2010；Wang et al.，2010；Ren et al.，2014），相关的遗传规律得到逐步解析。但一些重要的机理问题至今尚不清楚，如这些基因在水稻中如何定量调控其蛋白质含量，在蛋白质合成、转运和积累过程中如何与别的因子协同发挥功能，以及多个蛋白质合成相关基因间的调控网络等问题，将在今后针对已克隆基因功能的深入研究中逐渐得到解密。

随着水稻功能基因组的快速发展和分子标记辅助选择体系的建立与完善，对已检测到遗传效应较大的QTL，可尝试转移和聚合其中比较稳定表达的QTL，从而提高水稻种子的蛋白质含量，进而改善稻米营养品质；还可充分利用我国种质资源库中丰富的水稻种质资源开展筛选与鉴定工作，从而有效地利用高蛋白质含量的水稻资源，发掘新基因并深入研究其功能及其调控规律。同时，可利用分子标记辅助选择将相关控制高蛋白质的基因或QTL转移或聚合到现有的优良栽培品种中，培育稻米市场广泛需求的优质水稻新品种。

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（責任编辑 思利华）