滕安娜 赵京岚 王燕

摘要 [目的]筛选黄瓜根际促生真菌，并探索其促生效应。[方法]以解磷、产IAA和拮抗黄瓜枯萎病菌能力为筛选标准测定初筛菌株的多项促生能力；通过种子萌发和盆栽试验测定菌株对黄瓜的促生效应；通过形态鉴定和rDNA-ITS序列分析对促生菌株进行分类学鉴定。[结果]从连作黄瓜根际土壤中分离到1株同时具解磷、产IAA和拮抗黄瓜枯萎的真菌，该菌株孢子悬浮液能有效促进黄瓜种子萌发和幼苗生长。形态学和分类学鉴定结果显示该菌株为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。[结论]所筛选的促生真菌能有效改善黄瓜连作障碍，为开发研制黄瓜专型促生制剂提供良好的种质资源。

关键词 连作障碍；根际促生真菌；哈茨木霉

中图分类号 S642.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0039-02

Screening of Plant Growth-promoting Rhizofungi and the Promoting Effects on Cucumber

TENG An-na1 ，ZHAO Jing-lan1，WANG Yan2

（1.Department of Biotechnology Engineering，Taishan Polytechnic，Taian，Shandong 271000；2.Dongying Entry-Exit Insperction and Quarantine Bureau，Dongying，Shandong 257000）

Abstract [Objective]To screen plant growth-promoting rhizo fungi and study the growth-promoting effect. [Method]The growth-promoting effects of screening rhizofungi were measured by the standard of the abilities of phosphate solubilization， production of indoleacetic acid （IAA） and antagonistic activity against Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum.Seeding germination and pot experiments were conducted to measure the growth-promoting effects on cucumber.The growth-promoting rhizofungi were classified and indentified by morphological and rDNA-ITS sequence analysis. [Result]One strain was isolated which had the abilities of phosphate solubilization， production of IAA and antagonistic activity against F. oxysporum f.sp.cucumerinum. The spore suspension of this strain could improve germination and promote cucumber seedling growth， which was indentified as Trichoderma harzianum by morphological and rDNA-ITS sequence analysis.[Conclusion]The isolated growth-promoting rhizofungi could solve the continuous cropping obstacles of cucumber and will be helpful for developing the specially microbial inoculants or bio-organic fertilizers of cucumber.

Key words Continuous cropping obstacles；Plant growth-promoting rhizofungi；Trichoderma harzianum

黄瓜是设施蔬菜生产中的主要栽培作物，其连作障碍日益严重，土壤肥力下降，枯萎病发病严重，造成黄瓜产量和品质下降。连作障碍已成为制约我国黄瓜产业发展的瓶颈。

根际是由植物根系与土壤微生物之间相互作用形成的独特圈带，其中植物根际促生细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria）研究较为广泛，大量数据显示，这类促生菌一般具有固氮、解磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少其中1種能力，可促进植物生长、防治病害、增加作物产量[1]。真菌作为土壤微生物群落的重要组成部分，对植物生长发育有重要影响，但目前对根际促生真菌（Plant growth-promoting rhizofungi）的研究和报道较少。

促生菌对植物有一定的种属专一性和选择性。为解决黄瓜连作障碍问题，该研究从其根际土壤中筛选具有促生效应的真菌，为进一步开发具促生防病效果的根际真菌提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄瓜根际土壤采自泰山职业技术学院实习基地；黄瓜种子为新津研4号；病原菌为黄瓜枯萎病原真菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）。

1.2 促生真菌筛选

取10 g黄瓜根际土壤加入到装有90 mL无菌水的三角瓶中，28 ℃、170 r/min振荡培养30 min，梯度稀释后，分别取0.1 mL稀释液涂布于PDA平板上，28 ℃培养48 h，挑取菌落形态各异的真菌，纯化后编号保存。

1.2.1 解磷能力测定。

将分离纯化的菌株点接至含不溶性磷酸盐的培养基中，通过透明圈试验，筛选出具备解磷能力的菌株[2]。解磷能力定量测定采用钼酸铵比色法，以不接菌培养基中有效磷含量为对照[3]。

1.2.2 产IAA能力测定。

将分离纯化后的菌株接种于液体查氏培养基中（含诱导物色氨酸0.5 g/L），用Salkowski试剂筛选出产IAA的菌株。用分光光度法定量检测产IAA能力，以不添加诱导物的培养基中IAA含量为对照[4]。

1.2.3 抑菌能力测定。

将黄瓜枯萎病菌（提前2 d接种）和已分离纯化的菌株接种至PDA培养基中，通过对峙培养筛选出能拮抗黄瓜枯萎的菌株，并于显微镜下观察菌丝体的作用方式。

1.3 种子萌发试验

将待测菌孢子悬浮液加入半固体MS培养基中至终浓度1×106个/mL 。精选大小一致、颗粒饱满、无缺损的黄瓜种子，表面消毒后播于上述半固体MS培养基中，以无菌水为对照，36 h后测黄瓜萌发率，10 d后测黄瓜胚根生长状况[5]。

1.4 盆栽试验

待黄瓜幼苗两叶一心时选取大小一致的植株，用待测菌孢子悬浮液（1×106个/mL）进行灌根处理，以无菌水为对照，15 d后测量黄瓜幼苗的株高、地上鲜重以及植株叶片磷、硝态氮、叶绿素、类胡萝卜素的含量[6]。

1.5 菌株鉴定

根据菌落和孢子形态特征及rDNA-ITS序列分析对菌株进行鉴定，采用NCBI的BLAST以及Clustalx1.83、MEGA5.1软件进行多重序列比较，构建系统发育树（Bootstrap值=1 000）。

1.6 数据处理

采用Excel与SPSS 19.0软件进行数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 促生真菌筛选

通过初筛共获得12株真菌，其中T3-5兼具解磷（图1）和产IAA能力（图2），并对黄瓜枯萎病菌有良好的拮抗作用和重寄生作用（图3、4），将该菌株作为供试菌株用于种子萌发和盆栽试验。

2.2 种子萌发试验

T3-5孢子悬浮液可有效提高黄瓜种子萌发率并促进胚根发育（图5），与对照相比，黄瓜种子萌发率提高23.3%，胚根长增加12.6%，侧根原基数目增加26.2%。

2.3 盆栽试验

T3-5孢子悬浮液灌根处理15 d可促进黄瓜幼苗生长（图6），株高、地上鲜重分别比CK增加 11.38%、38.47%，叶片磷含量、硝态氮含量、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量分别提高了19.86% 、12.72%、56.24%、21.23%、39.59%。

2.4 菌株鉴定

菌落暗绿色，背面不变色。孢子梗丛束疏松，瓶梗短，基部变细，中间膨大。分生孢子球形，短倒卵形。根据分子测序结果与该菌株相近的ITS 序列构建系统发育树（图6），该菌株与哈茨木霉（Trichoderma harzianum）位于系统发育树的同一分支，并与木霉属的其他种有所区别。

3 讨论

黄瓜种植面积不断扩大，并实现周年生产，但其连作障碍日益凸显，目前国内外学者主要采用农业和化学措施来缓解连作障碍问题，但由于化肥、农药的大量使用对环境造成了严重污染，因此生防菌的施用成为连作障碍防治研究熱点。该研究从黄瓜根际土壤中筛选出1株具有促生防病效果的哈茨木霉T3-5，拟为开发研制黄瓜专型促生制剂提供良好的种质资源。

试验结果显示，T3-5具有解磷、产IAA和拮抗黄瓜枯萎病菌能力，这与已报道的哈茨木霉特性相吻合。国内外已有大量研究报道木霉属菌株可以促进植物种子萌发、植株生长和开花、提高作物产量等[7]，但对于木霉菌用于解决连作黄瓜障碍问题研究较少。该研究所筛选菌株的孢子悬浮液能有效促进连作黄瓜幼苗生长，对于该菌株的促生效果、促生机制及菌肥的制备还有待进一步研究探讨。

参考文献

[1] 胡江春，薛德林，马成新，等.植物根际促生菌（PGPR）的研究与应用前景[J].应用生态学报，2004，15（10）：1963-1966.

[2] 康贻军，胡健，单君，等.两株解磷真菌的解磷能力及其解磷机理的初步研究[J].微生物学通报，2006，33（5）：22-27.

[3] GREINER R，HALLER E，KONIETZNY U，et al.Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena[J].Arch Biochem Biophys，1997，341（2）：201-206.

[4] 张东艳，刘晔，吴越，等.花生根际产IAA菌的筛选鉴定及其效应研究[J].中国油料作物学报，2016，38（1）：104-110.

[5] CONTRERAS-CORNEJO H A，MACAS-RODRGUEZ L，CORTS-PENAGOS C，et al.Trichoderma virens，a plant beneficial funfus，enhances biomass production and promotes lateral root growth through an auxin-dependent mechanism in Arabidopsis[J].Plant physiology，2009，149（3）：1579-1592.

[6] 王学奎.植物生理生化实验原理和技术[M].2版.北京：高等教育出版社，2000.

[7] HARMAN G E.Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp.[J]. Phytopathology，2006，96（2）：190-194.