邓辰红　王飞　王文兰　朱华

【摘要】 目的 对兔骨髓基质干细胞的培养方法、鉴定及标记技术进行初步研究。方法 采用贴壁法培养幼年兔骨髓细胞， 经反复传代细胞逐渐纯化， 以流式细胞术检测细胞表面抗原。以5-溴脱氧尿嘧啶核苷 （BrdU）标记骨髓基质干细胞， 将骨髓基质干细胞注入兔脑内， 2周后取脑作石蜡切片， 进行免疫荧光染色。结果 通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的细胞， 并能在体外长期培养。CD31的阴性率为5.67%， CD34的阴性率为4.31%， CD45的阴性率为4.42%， CD44的阳性率为98.82%， CD71的阳性率为99.17%， CD90的阳性率为98.23%。提示CD31、CD34、CD45 的结果为呈阴性， CD44、CD71、 CD90的结果为阳性， BrdU能够掺DNA合成期的骨髓基质干细胞。结论 贴壁法可获得高纯度的骨髓基质干细胞， BrdU可作为骨髓基质干细胞体内示踪的理想标记物。

【关键词】 骨髓基质干细胞；CD分子；5-溴脱氧尿嘧啶核苷

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.32.091

【Abstract】 Objective To briefly research culture， identification and mark of rabbit bone marrow stroma stem cells. Methods Bone marrow cells of young rabbits were cultured by adhesion method for purification by repeated passage， and cell surface antigen was detected by flow cytometry. Bone marrow stroma stem cells marked by 5-bromodeoxyuridine （BrdU） was injected into rabbit brain for immunofluorescent staining of brain paraffin section after 2 weeks. Results Bone marrow cells cultured by adhesion method provided purified cells suitable for long-term culture in vitro. CD31 had negative rate as 5.67%， CD34 had negative rate as 4.31%， CD45 had negative rate as 4.42%， CD44 had positive rate as 98.82%. CD71 had positive rate as 99.17%. CD90 had positive rate as 98.23%. CD31， CD34 and CD45 showed negative outcome， and CD44， CD71 and CD90 showed positive outcome. BrdU was suitable to be taken by bone marrow stroma stem cells in DNA synthesis. Conclusion Adhesion method provides bone marrow stroma stem cells with high purification， and BrdU can be used as ideal marker for in vivo tracking bone marrow stroma stem cells.

【Key words】 Bone marrow stroma stem cells； CD molecule； 5-bromodeoxyuridine

骨髓基质细胞是一种不具有造血功能的细胞， 由于该细胞容易取材， 并且可以体外扩增以及多向分化等优点， 逐渐成为受到广泛研究[1-4]。本文作者主要对兔骨髓基质干细胞的培养、鉴定以及标记作简单探究。

1 材料与方法

1. 1 材料与试剂 ①材料：本文选择的研究对象为幼兔， 主要来源于内蒙古实验动物中心。②试剂：主要有Gibco生产的胎牛低血清糖DMEM， 由Serotec公司生产的CD71、CD31、CD45mAb， 由Sigma生产的MTT、BrdU， 由Biolegend公司生产的经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD45和CDmAb， 剩余试剂则由我国生产。

1. 2 方法

1. 2. 1 原代培养骨髓基质干细胞 将幼兔采用脱颈的方式将其处死， 在充分消毒以后取出两侧的股骨， 中断股骨并反复用肝素生理盐水进行冲洗， 主要是将骨髓细胞冲出， 将冲出的骨髓细胞加入至容量为200 ml的LG-DMEM培养液中， 将其在室温为37℃环境中进行培养， 培养2 d后更换一半培养液， 以后每隔1～2 d在更换一半的培养液， 等到7～8 d后便可以实现1次传代[5-8]。

1. 2. 2 骨髓基質干细胞鉴定 将经上述步骤培养出的第六代并且已纯化的骨髓基质干细胞消化， 在计数之后将其倒入离心管内， 使用磷酸盐缓冲液（PBS） 0.01 mol/L洗涤1次， 离心的时间控制在5 min， 离心的转速为800 r/min， 离心成功后， 再将其加入至200 μl的PBS重悬细胞中， 加入FITC分别标记出小兔的CD31、CD34、CD45、CD90、CD44、CD71， 在室温为37℃以及无关的环境下反应1 h， 待反应结果后， 在使用聚甲醛40 g/L进行固定， 最后检测流式细胞数[9-12]。

1. 2. 3 BrdU标记骨髓基质干细胞的体外研究 选择处于对数生长期的骨髓基质干细胞开展细胞爬片， 等到细胞生长到一半时加入BrdU， 待2 d后取出玻璃片用PBS 0.01 mol/L洗涤， 运用多聚甲醛固定好后开展免疫组化和免疫荧光染色， 最后封面进行观察。

1. 2. 4 BrdU标记骨髓基质干细胞的体内研究 在幼兔颅内注射经过BrdU标记的骨髓基质干细胞， 3周后脱颈处死并取出脑， 在穿刺点附近开展石蠟切片后开展免疫荧光染色。具体步骤为：首先， 常规脱蜡至水， 分别用30 ml/L 过氧化氢（H2O2）、2 mol/L 氯化氢（HCl）、4 g/L的胃蛋白酶、10 g/L

牛血清白蛋白室温封闭约10 min， 加入2 mol/L HCl， 室温下孵育30 min， 再将4 g/L的胃蛋白酶室温孵育30 min， 然后兔抗BrdUmAb（1∶100）在湿盒中孵育过夜， 温度为4℃；然后将TRITC标记抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶100）在室温下孵育40 min， 最后在用PBS和蒸馏水洗涤， 封片观察[13-16]。选择同一个组织切片随机选择6个不同的视野分别计算阳性率， BrdU标记阳性率=6个不同的视野分别计算阳性率/6个视野细胞总数×100%。

2 结果

2. 1 骨髓基质干细胞培养结果 在对小兔骨髓基质干细胞培养的初期， 能够看见很多悬浮的细胞， 再培养2 d后发现了一些形状为纺锤形的贴壁细胞呈分散状态， 在经过数次更换培养液后， 贴壁上的细胞数量不断减少直至消失， 4 d后可以发现贴壁的纺锤细胞数量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他细胞， 但是在经过数次传代培养以后， 混杂细胞逐渐纯化， 细胞初期的以集落增长， 但是在第六代之后均为均匀分布的纺锤形。

2. 2 骨髓基质干细胞的鉴定 经鉴定发现， CD31的阴性率为5.67%， CD34的阴性率为4.31%， CD45的阴性率为4.42%， CD44的阳性率为98.82%， CD71的阳性率为99.17%， CD90的阳性率为98.23%。

2. 3 骨髓基质干细胞体内外标记 将小兔的骨髓基质干细胞免疫组化以后， 结果可以观察到呈棕色的阳性细胞分布， 选择相同的组织片中6个视野不同进行观察， 并将阳性率计算出来， 然后再分别计算不同的标本， 经计算， BrdU标记的细胞所占的比例为87.6%。在运用免疫荧光染色之后发现细胞核染色显著， 但若将BrdU标记骨髓基质干细胞注入体内， 3周以后依然可以看到明显的BrdU着色， 并且在穿刺位置还发现密集的细胞。

3 讨论

骨髓基质干细胞属于一类具有多向分化潜能的干细胞， 当理化环境不同和受到细胞因素诱导时， 可以进一步向成软骨、成骨、脂肪以及纤维细胞系等[17-19]进行多方向性扩增和分离， 并且骨髓基质干细胞还容易被外源基因感染， 因此当前成为基因治疗和组织工程的较理想的靶细胞。因此如何获取并纯化骨髓基质干细胞已经成为医学界研究的重大课题。分离和纯化骨髓基质干细胞的基本原则为细胞的粘附性。当前， 从骨髓中获得基质干细胞常采用两种途径[20]：①为梯度离心法获得干细胞；②为全骨髓细胞培养。

本研究通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的细胞， 并能在体外长期培养， 结果提示：骨髓基质干细胞培养在对小兔骨髓基质干细胞培养的初期， 能够看见很多悬浮的细胞， 再培养2 d后发现了一些形状为纺锤形的贴壁细胞呈分散状态， 在经过数次更换培养液后， 贴壁上的细胞数量不断减少直至消失， 4 d后可以发现贴壁的纺锤细胞数量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他细胞， 但是在经过数次传代培养以后， 混杂细胞逐渐纯化， 细胞初期的以集落增长， 但是在第六代之后均为均匀分布的纺锤形。骨髓基质干细胞的鉴定：经鉴定发现， CD31的阴性率为5.67%， CD34的阴性率为4.31%， CD45的阴性率为4.42%， CD44的阳性率为98.82%， CD71的阳性率为99.17%， CD90的阳性率为98.23%。骨髓基质干细胞体内外标记：将小兔的骨髓基质干细胞免疫组化以后， 结果可以观察到呈棕色的阳性细胞分布， 选择相同的组织片中6个视野不同进行观察， 并将阳性率计算出来， 然后再分别计算不同的标本， 经计算， BrdU标记的细胞所占的比例为87.6%。在运用免疫荧光染色之后发现细胞核染色显著， 但若将BrdU标记骨髓基质干细胞注入体内， 3周以后依然可以看到明显的BrdU着色， 并且在穿刺位置还发现了密集的细胞。

综上所述， CD31、CD34、CD45 的结果为呈阴性， CD44、CD71、 CD90的结果为阳性。BrdU可掺DNA合成期的骨髓基质干细胞， 由此得出贴壁法可获得高纯度的骨髓基质干细胞， BrdU可作为骨髓基质干细胞体内示踪的理想标记物， 依此可以作为检测骨髓基质干细胞的一个依据。

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[收稿日期：2016-10-22]