张瑜++鄢家俊++马海天才++白史且++张建波++张劲++彭燕++李达

旭

摘要：为建立斑茅[Erianthus arundinaceum （Retz.） Jeswiet.]的组织培养再生体系，以斑茅的成熟种子为材料，对愈伤组织诱导、芽分化和根分化中的植物生长调节剂配比及浓度进行了筛选。结果表明，①MS中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA与1.0～3.0 mg/L的2，4-D愈伤诱导率最高；MS中添加0.5 mg/L的2，4-D时胚性愈伤诱导率达54.29%。②MS中添加0.5 mg/L的6-BA与1～2 mg/L的KT更易促进芽的分化，芽分化率71.11%。③1/2MS中添加20 g/L的蔗糖促进生根效果最好，根分化率96.97%。

关键词：斑茅[Erianthus arundinaceum （Retz.） Jeswiet.]；愈伤诱导；再生体系；6-BA；2，4-D；KT

中图分类号：S566 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1570-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.043

Callus Induction of Mature Seed of Erianthus arundinaceus and Establishment

of the Regeneration System

ZHANG Yu1， YAN Jia-jun1， MAHAI Tian-cai2， BAI Shi-qie1，

ZHANG Jian-bo1， ZHANG Jin1， PENG Yan3， Li Da-xu1

（1.Sichuan Grassland Science Academy， Chengdu 611731， China； 2.Sichuan Sihai Brilliant Ecological Environment Engineering Co.， Ltd.， Chengdu 610041， China；3.Department of Grassland， Sichuan Agricultural University， Yaan 625014， Sichuan， China）

Abstract： For establishing the regeneration system of Erianthus arundinaceus， mature seed of Erianthus arundinaceus was used as test material， the phytohormone combination and phytohormone concentration of callus induction， bud initiation and striking root of Erianthus arundinaceus were screened. The results showed that： ①The highest callus induction efficiency used the MS-medium adding 0.1～0.2 mg/L 6-BA and 1.0～3.0 mg/L 2，4-D. Induction rate of embryonic callus was 54.29% using MS-medium adding 0.5 mg/L 2，4-D. ②Bud initiation was 71.11% using MS-medium adding 0.5 mg/L 6-BA and 1～2 mg/L KT. ③Striking root initiation was 96.97% using 1/2 MS-medium adding 20 g/L Cane sugar.

Key words： Erianthus arundinaceum（Retz.） Jeswiet.； callus induction； regeneration system； 6-BA； 2，4-D； KT

斑茅[Erianthus arundinaceum（Retz.） Jeswiet.]是蔗茅屬（Erianthus）多年生草本植物，具有适应性强、生物量大、富含纤维素等特性，为潜在的能源植物。以斑茅作为能源植物代替玉米、甘蔗、高粱等粮食作物来生产新型清洁能源燃料乙醇，具有不与人畜争粮、不与粮争地，降低碳排放，打破目前以不可再生的石油为主要能源的局面，缓解能源危机。在美国与欧洲，柳枝稷（Panicum virgatum）、芒属（Miscanthus）作为能生产燃料乙醇的能源草研究较多[1-4]；而在中国，柳枝稷也被引进作为能源草研究[5-8]，但对于在中国广泛分布、具有本土优势的斑茅用于能源开发的研究起步较晚。Tew等[9]将斑茅植物基因用于改良能源用甘蔗，Santiago等[10]就甘蔗及其近缘种斑茅等作为能源用植物进行了系统阐述。2009年，四川草原科学研究院能源草研究团队开始对中国国内大部分地区的斑茅资源进行了广泛收集与评价[11，12]，同时从斑茅的外部形态[13]、遗传多样性[14，15]、能源用潜力评价方面[16]做了大量研究，宁祖林等[17]、曾汉元等[18]对斑茅进行能源用潜力评价，但对斑茅纤维发酵工艺研究仍处在探索性研究阶段[19]。

斑茅虽富含纤维素，但其木质素的特殊结构，使得纤维素酶呈不可逆状态吸附在木质素上，降低纤维素酶的活性，使得纤维素本身难以分解[20]，木质素含量高成为其生产燃料乙醇的主要障碍。本研究旨在筛选愈伤组织诱导、愈伤组织分化的最佳植物生长调节剂配比及浓度，优化斑茅再生体系，为利用RNAi技术创制低木质素斑茅材料提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

斑茅野生植株采集于海南昌江路边荒地（19°19′N，108°58′E），保存于四川省大邑县韩场镇四川省草原科学研究院基地内；斑茅种子于2013年9-12月收集。

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理 以斑茅种子为外植体，将采集回的斑茅成熟种子用镊子剥出，无菌水浸泡12 h备用。消毒处理为70%乙醇浸泡30 s，无菌水漂洗2～3次，用0.1% HgCl2溶液表面灭菌7～10 min，无菌水漂洗3～5次。

1.2.2 愈伤组织的诱导 愈伤组织诱导采用培养基配方为MS+A（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 2，4-D）+B（0、0.5、1.0、1.5、3.0、6.0 mg/L 6-BA）+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，调节培养基pH为5.8。其中6-BA和2，4-D的处理浓度共计36个处理组合，每瓶接种20块外植体，每个处理5个重复，置于25 ℃下暗培养，每隔20 d左右更换一次新鲜培养基。暗培养20 d左右后统计愈伤诱导率；再培养4周后统计胚性愈伤率，胚性愈伤为颗粒状、致密的淡黄色或者淡绿色的愈伤组织。愈伤诱导率=（出愈数/接种数）×100%；胚性愈伤诱导率=（胚性愈伤数/出愈数）×100%。

1.2.3 愈伤组织的继代培养 在暗培养条件下，将培养出的胚性愈伤组织，剥离后转到2，4-D 1 mg/L、6-BA 0.2 mg/L的培养基上进行继代培养，温度（25±1） ℃，每隔20 d左右更换一次新鲜培养基。

1.2.4 芽分化 经过继代培养，将结构致密、颗粒状、淡黄色的胚性愈伤组织转移至分化培养基上，芽分化培养基为MS+C（0.5、1.0 mg/L 6-BA）+D（0.5、1.0、2.0 mg/L KT）+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，调节培养基pH为5.8，共计6个处理组合，每瓶接种10块愈伤，每个处理5个重复。置（25±1）℃、2 000 lx下光照培养。每隔20 d左右更换一次新鲜培养基，逐渐生出丛生芽，形成无根幼苗，统计分化率。芽分化率=（分化出芽的愈伤数/接种的愈伤数）×100%。

1.2.5 根分化 将幼苗转移至生根培养基中，根分化培养基为E（MS、1/2MS）+F（10、20、30 g/L蔗糖）+琼脂7 g/L，调节培养基pH为5.8，6个处理组合，每瓶接种正常芽分化愈伤10块，每个处理设5次重复。置（25±1）℃、2 000 lx下光照培养，每隔20 d左右更换一次新鲜培养基，统计生根率。根分化率=（生根苗数/接种的幼苗数）×100%。

1.3 数据处理

利用SPSS软件对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的2，4-D和6-BA对斑茅愈伤组织诱导的影响

从表1中可以看出，在36个处理中，有17个处理的愈伤诱导率在76.67%以上，且17個处理差异不显著；2，4-D浓度为0 mg/L的6个处理未能诱导出愈伤组织，说明在斑茅的愈伤诱导中不能缺少2，4-D；愈伤诱导率在93.00%以上的处理共有6个，其中6-BA浓度为0.2 mg/L有4个，说明该浓度的6-BA更有利于斑茅愈伤组织的形成。A2B5、A3B3、A3B4的愈伤诱导率均为100.00%，说明这3个处理的愈伤诱导的效果最好，即2，4-D浓度为1.0～3.0 mg/L。从产生胚性愈伤个数来看，处理A1B2高达5.00个，其次是处理A4B3（4.67个）以及A4B4和A3B3（3.33个），除2，4-D浓度为0 mg/L的6个处理没有形成胚性愈伤外，还有处理A2B6未形成胚性愈伤，说明适宜浓度的2，4-D是形成胚性愈伤的关键。从胚性愈伤诱导率来看，50.00%以上的处理只有A1B2；40.00%以上的处理有A4B3、A6B2和A6B5；2，4-D浓度为0 mg/L的6个处理与A2B6胚性愈伤诱导率为0.00%。故MS中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA与1.0～3.0 mg/L的2，4-D是诱导斑茅愈伤组织的最佳配比。

2.2 不同浓度的6-BA和KT对斑茅愈伤分化成芽的影响

从表2中可以看出，处理C1D2和C1D3的芽分化率最高，均为71.11%，显著高于其他处理；其后依次为C1D1（46.67%）、C2D1（35.56%）、C2D2（33.33%）和C2D3（28.89%），4个处理均差异不显著。故MS中添加0.5 mg/L的6-BA与1.0～2.0 mg/L的KT是促进斑茅愈伤组织分化成芽的最佳配比。

2.3 不同培养基和不同浓度蔗糖对斑茅愈伤分化生根的影响

以1/2MS和MS培养基添加不同浓度的蔗糖来诱导幼苗生根。从表2中可以看出，分化率最高的处理是E1F2（96.97%），其后依次是E1F3（89.75%）、E1F1（77.78%）、E2F1（72.22%）、E2F3（60.61%）和 E2F2（53.33%）。E1F2和E1F3差异不显著，但是显著高于其他4个处理。故1/2MS中添加20 g/L的蔗糖促进生根效果最好。

3 小结与讨论

生长调节剂在组织培养中有着重要的作用。在斑茅的再生体系研究中，通过在MS培养基中调整生长调节剂种类和浓度来研究其对斑茅愈伤组织诱导的影响。结果表明，2，4-D是斑茅形成愈伤的限制性因子，即所有2，4-D浓度为0 mg/L的处理均未产生愈伤，这与前人的研究结果一致[21]。斑茅愈伤组织诱导率与2，4-D浓度呈一定相关性[22]，在添加0～3.0 mg/L 2，4-D的范围内愈伤诱导率随着2，4-D浓度的增高而增高，当超过3.0 mg/L则出现了抑制现象，且随着浓度的增高，抑制现象更加明显；同样添加6-BA对愈伤诱导有促进作用，但浓度超过0.3 mg/L后也出现了抑制现象。本研究还发现MS中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA与1.0～3.0 mg/L的2，4-D愈伤诱导率最高， 6-BA浓度为0 mg/L、2，4-D浓度为0.5 mg/L的胚性愈伤诱导率最高，愈伤诱导率则约为90.00%，2，4-D和6-BA配合使用的愈伤组织诱导率要高于单独使用2，4-D[23]。但愈伤诱导率越高不等于可用的胚性愈伤就越多，而胚性愈伤才是形成再生苗的关键，筛选最佳生长调节剂要综合诱导愈伤与诱导胚性愈伤两者。故本研究得出MS中添加0.1～0.2 mg/L的6-BA与1.0～3.0 mg/L的2，4-D愈伤诱导率最高；MS中添加0.5 mg/L的2，4-D胚性愈伤诱导率最高。在根分化中，在1/2MS培养基中添加20g/L的蔗糖效果最好。其次是 1/2MS培养基中添加30 g/L蔗糖，说明在生根分化中1/2MS培养基配方优于MS培养基，且适当降低蔗糖含量更有利于幼苗的生根。

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