郭桂元 黄子成 林婵婵 黄志鹏

(泉州市第一医院消化内科，福建 泉州 362000)

氯化两面针碱对人胃癌细胞增殖、迁移的抑制作用

郭桂元 黄子成 林婵婵 黄志鹏

(泉州市第一医院消化内科，福建 泉州 362000)

目的 探讨氯化两面针碱(NC)对人胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移的作用及其机制。方法 MTT实验检测NC对SGC-7901细胞的增殖作用； Transwell小室实验检测NC对SGC-7901细胞迁移和侵袭的影响；Western印迹检测NC对人胃癌SGC-7901细胞中Bax,Bcl-2,PCNA,MMP2,MMP1和GAPDH表达的影响。结果 MTT实验表明NC抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，并且呈时间、剂量依赖性(P<0.05)；此外，NC显著抑制SGC-7901细胞中PCNA表达，呈剂量依赖性(P<0.05)；Transwell小室实验表明NC显著抑制SGC7901细胞迁移和侵袭，呈剂量、时间依赖性(P<0.05)；Western印迹表明NC上调凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制MMP1以及MMP2的表达(均P<0.05)。结论 NC通过诱导细胞凋亡抑制SGC-7901细胞增殖，通过降解MMP1和MMP2从而抑制SGC-7901细胞侵袭和迁移。

氯化两面针碱；人胃癌SGC-7901细胞；增殖；侵袭；迁移

胃癌特征就是细胞增殖、迁移以及侵袭不受控制〔1〕。胃癌早期很难诊断，一般确诊时已进入晚期〔2〕。两面针来源于植物两面针的根，是天然的植物生物碱〔3〕。氯化两面针碱(NC)是两面针的氯化物，有抗感染〔4〕、抗疟〔5〕、抗真菌〔5〕、抗血管生成〔6〕以及抗肿瘤等活性〔7〕。NC抗肿瘤有一定的效果，然而，鲜有文章报道NC对于胃癌增殖、迁移的影响。本文旨在探讨NC对于人胃癌细胞SGC7901增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂：Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)和噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司，RPMI1640和胎牛血清(FBS)购自英国Hyclone 公司。Bax,Bcl-2,PCNA,MMP2,MMP1和GAPDH购自美国Cell Signaling Technology公司。NC购自Tauto Biotech公司，SGC-7901细胞购自中国Cell Resource Center of Life Sciences，培养在包含有10%FBS和100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素。在5%CO2和37℃培养箱中培养。细胞传代时用0.25%的胰酶处理。

1.2 方法

1.2.1 MTT实验 细胞增殖实验用MTT实验测定。SGC-7901细胞培养在96孔板中，接种密度为1×104，接种24 h，并且设置5个复孔。之后分两组处理。第一组用不同浓度NC处理细胞48 h。将NC溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，浓度分别为0、20、40、80 μmol/L。另外一组用40 μmol/L NC处理SGC-7901细胞24、48、72 h。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞之后，用20 μl的5 mg/ml MTT在37℃处理细胞4 h。弃掉MTT之后，每孔加入100 μl DMSO溶液。96孔板在室温下温和摇荡10 min。用酶联免疫检测仪在490 nm处检测吸光值。

1.2.2 Transwell小室实验 将基质胶溶液(培养基∶基质胶=7∶1)铺满Transwell小室底部，将Transwell小室放在细胞培养箱(5%CO2，37℃)中培养过夜，使底部的基质胶溶液凝固；将不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)或者不同时间(24、48、72 h)NC处理SGC-7901细胞培养直至细胞密度为1×106个/ml。用胰酶消化细胞，重悬的细胞培养在无血清培养基，细胞液加入上室，下室加入500 μl含有10%FBS培养基。培养24 h。之后用棉签擦拭基质胶以及上室的细胞。用95%乙醇处理小室10 min，晾干之后加入4 g/L结晶紫200 μl染色10 min。清水洗涤。取4个视野，记录通过半膜的细胞数，取平均值。

1.2.3 Western印迹实验 不同处理的细胞用PBS洗涤2次，然后用裂解液在冰上裂解30 min。然后用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测细胞裂解液的浓度。将50 μg蛋白上样于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶中，然后电转到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上。然后用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。Tris盐酸缓冲液(TBST)洗5 min，3次，然后孵育相应的一抗，并且4℃过夜；之后TBST洗涤5 min，3次；然后孵育二抗2 h；之后用化学发光液均匀撒在膜上，显影。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验，采用Image J软件对条带的灰度值进行定量分析，统计图采用GraphPad Prism5软件分析。

2 结 果

2.1 NC抑制SGC-7901细胞的增殖 见图1。0、20、40、80 μmol/L NC组细胞存活率分别为(91.2±2.56)%、(74.6±5.23)%、(52.6±3.14)%、(45.3±2.46)%，表明NC显著抑制SGC-7901细胞增殖，并且具有剂量依赖关系(P<0.05)。NC抑制SGC-7901细胞增殖还呈现时间依赖关系24、48、72 h细胞存活率分别为(72.3±3.26)%，(53.6±3.14)%,(38.1±2.07)%(P<0.05)。此外，Western印迹结果表明NC显著抑制SGC-7901细胞中PCNA表达，呈剂量依赖性0、20、40、80 μmol/L NC组PCNA相对表达量分别为(0.26±0.013)、(0.22±0.015)、(0.14±0.010)、(0.09±0.019)(P<0.05)。

2.2 Transwell chamber法检测NC对SGC-7901细胞迁移、侵袭的影响 采用浓度分别为20、40、80 μmol/L的NC处理SGC-7901细胞，穿过膜的数量〔(62.4±1.58)个、(49.2±1.21)个、(40.2±1.77)个〕少于对照组〔(86.2±3.67)个〕，并且呈剂量依赖性(P<0.05)。40 μmol/L NC处理SGC-7901细胞24、48、72 h后，Transwell实验结果显示SGC-7901细胞穿膜数量减少〔(64.6±2.13)个、(48.4±1.65)个、(32.6±1.73)个〕，呈时间依赖性(P<0.05)。见图2。

2.3 Western印迹 NC可以抑制SGC-7901细胞增殖，可能是通过诱导细胞凋亡实现的。NC可以抑制SGC-7901细胞侵袭、迁移，而降解细胞外基质(ECM)是细胞侵袭、迁移的关键，MMP1和MMP2是ECM降解酶〔13〕，可以降解基质或者非基质蛋白。不同浓度NC(0、20、40、80 μmol/L)处理SGC-7901细胞后，Bax蛋白表达上调〔(0.15±0.01)，(0.25±0.01)，(0.41±0.01)，(0.50±0.02)〕，Bcl-2蛋白表达减少〔(0.63±0.02),(0.48±0.02),(0.40±0.01),(0.31±0.01)〕，呈剂量依赖性(P<0.05)。MMP1〔(0.72±0.02,(0.58±0.01),(0.51±0.01),(0.43±0.01)〕和MMP2蛋白〔(0.73±0.05),(0.60±0.02),(0.48±0.02),(0.32±0.01)〕表达降低，呈剂量依赖性(P<0.05)。见图3。

图2 Transwell侵袭实验分析NC对SGC-7901细胞迁移、侵袭的影响

图3 在SGC-7901细胞中，用Western印迹检测不同浓度NC对Bax、Bcl-2、MMP1和MMP2表达影响

3 讨 论

胃癌的进展从原发部位到继发部位，从而导致在多级过程中迁移、侵袭。首先从原发部位分离之后迁移到ECM，然后渗入血管或者淋巴管，紧接着肿瘤细胞在脉管系统中存活进而形成继发性肿瘤〔8〕。从植物中提取的化学物质包括萜类、黄酮类、异硫氰酸酯类以及生物碱类都是从中药植物中提取〔9〕。NC通过ERK相关的信号通路诱导肾癌细胞的凋亡，并且伴随着Bax上调以及Bcl-2的下调〔10〕。NC通过c-scr-fak信号通路抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移〔11〕。本文发现NC抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移，其抑制作用呈剂量、时间依赖性。已有报道表明NC可以诱导肿瘤细胞凋亡〔10〕，推测NC抑制SGC-7901细胞增殖是通过诱导其凋亡。Bcl-2家族蛋白包括Bcl-2，Bcl-XL，Bad和Bax是凋亡通路关键的调节因子〔12〕。

本文进一步通过Transwell侵袭实验证实NC可以抑制SGC-7901细胞侵袭。MMPs是一种Zn2+依赖的内源性蛋白酶，能够降解ECM从而促进细胞侵袭和迁移。Western印迹实验结果表明NC抑制MMP1和MMP2表达，呈剂量依赖性。

综上所述，NC通过诱导细胞凋亡抑制SGC-7901细胞增殖，通过降解MMP1和MMP2从而抑制SGC-7901细胞侵袭和迁移。NC可能成为治疗胃癌的新型药物。

1 邹文斌，李兆申.中国胃癌发病率及死亡率研究进展〔J〕.中国实用内科杂志,2014;34(4):408-15.

2 Busweiler LA,Wijnhoven BP,van Berge HM,etal.Early outcomes from the Dutch upper gastrointestinal cancer audit〔J〕.Br J Surg,2016;103(13):1855-63.

3 刘丽敏，刘华钢.氯化两面针碱的研究近况〔J〕.时珍国医国药,2007;18(1):60-2.

4 李丹妮，刘华钢，刘丽敏，等.氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的研究〔J〕.西安交通大学学报(医学版),2009;30(1):40-3.

5 Chen J,Wang J,Lin L,etal.Inhibition of STAT3 signaling pathway by nitidine chloride suppressed the angiogenesis and growth of human gastric cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2012;11(2):277-87.

6 程翔宇.氯化两面针碱对前列腺癌细胞抑制增殖、侵袭与诱发凋亡的研究〔D〕.济南：山东大学,2015.

7 王 勇，杨永滨，马玉琛.MMP1,MMP2和TIMP2在雄附方干预大鼠肺间质纤维化中的作用〔J〕.解放军医学院学报,2013；34(4):376-8.

8 Hood JD,Cheresh DA.Role of integrins in cell invasion and migration〔J〕.Nat Rev Cancer,2002;2(2):91-100.

9 王跃虎，牛红梅，张兆云，等.重楼属植物的药用价值及其化学物质基础〔J〕.中国中药杂志,2015；40(5):833-9.

10 Zhai H,Hu S,Liu T,etal.Nitidine chloride inhibits proliferation and induces apoptosis in colorectal cancer cells by suppressing the ERK signaling pathway〔J〕.Mol Med Rep,2016;13(3):2536-42.

11 Pan X,Han H,Wang L,etal.Nitidine chloride inhibits breast cancer cells migration and invasion by suppressing c-Src/FAK associated signaling pathway〔J〕.Cancer Lett,2011;313(2):181-91.

12 Lohmann CM,League AA,Clark WS,etal.Bcl-2:bax and bcl-2:Bcl-x ratios by image cytometric quantitation of immunohistochemical expression in ovarian carcinoma:correlation with prognosis〔J〕.Cytometry,2000;42(1):61-6.

〔2016-11-25修回〕

(编辑 袁左鸣)

郭桂元(1974-)，男，副主任医师，主要从事消化系统肿瘤研究。

R28

A

1005-9202(2017)09-2137-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.023