姜黄素对2型糖尿病肾病模型大鼠肾脏氧化应激以及脂质代谢的保护作用

2017-05-25马丽芬苏振丽王文科闫丽娟

中国老年学杂志 2017年9期

关键词：素处理姜黄肾小球

马丽芬苏振丽王文科闫丽娟

(宝鸡市中心医院内分泌科，陕西宝鸡 721008)

姜黄素对2型糖尿病肾病模型大鼠肾脏氧化应激以及脂质代谢的保护作用

马丽芬苏振丽王文科闫丽娟

(宝鸡市中心医院内分泌科，陕西宝鸡 721008)

目的从氧化应激和脂质代谢方面探究姜黄素是否可以缓解糖尿病肾病。方法将动物随机分为3组，以Long-Evans-Tokushima-Otsuka大鼠作为正常对照组(CON组)；以Otsuka-Long-Evans-Tokushima Fatty (OLETF)大鼠作为糖尿病(DM)组；以姜黄素(100 mg·kg-1·d-1)处理OLETF大鼠作为姜黄素处理组(CUR组)，检测各组大鼠体重和肾脏重量，在45 w时检测血糖、脂联素、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。用酶联免疫吸附(ELISA)实验检测尿液中超氧化物歧化酶(SOD)，高效液相色谱检测尿液中丙二醛(MDA)，电镜观察肾脏组织中肾小球基底膜和裂孔，用Western印迹实验检测AMPK通路相关蛋白以及Nrf2相关蛋白表达情况。结果姜黄素能够降低大鼠蛋白尿，降低血清中TG、TC以及游离脂肪酸水平，并且通过AMPK通路降低脂质积累；姜黄素可通过Nrf2通路缓解氧化应激，逆转葡萄糖引起的肾小球基底膜病理生理改变。结论在糖尿病肾病中，姜黄素通过Nrf2和AMPK信号通路抑制氧化应激和脂质积累，从而发挥保护作用。

姜黄素；糖尿病肾病；AMPK信号通路；Nrf2信号通路

糖尿病肾病(DN)是常见的肾脏疾病，也是糖尿病(DM)常见并发症，在全球具有较高的死亡率〔1，2〕。在DM早期阶段，升高的血糖超过肾脏从超滤液中重吸收葡萄糖的能力〔3〕，导致葡萄糖积累，增加渗透压和尿液体积。在DM发展期，高血糖和肾小球高滤过导致蛋白尿，进而导致基底膜增厚、肾小球膜扩张及肾小球硬化〔4，5〕。2型糖尿病(T2DM)往往伴随着血脂升高，例如总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和游离脂肪酸〔6〕。有研究报道肾脏脂质积累诱发的氧化应激可能导致肾脏功能紊乱〔7〕。姜黄素是植物姜黄(Curcuma Longa Linn)根茎主要活性成分，微黄的姜黄素具有抗癌、抗氧化和抗感染的作用〔8，9〕。已有研究报道姜黄素可以用于治疗肾病、血管疾病以及视网膜病等〔10～12〕，有报道称姜黄素的抗氧化作用是通过上调超氧化物歧化酶(SOD)而实现〔13〕。在脂质代谢方面，姜黄素可降低胆固醇以及DM患者中血液和尿中脂质氧化物〔14〕。姜黄素可能减少DN脂质代谢和氧化应激。本次研究探讨姜黄素是否能够降低T2DM伴DN大鼠模型中脂质代谢和氧化应激以及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Long-Evans-Tokushima-Otsuka大鼠和Otsuka-Long-Evans-Tokushima Fatty (OLETF) 大鼠购自Otsuka Pharmaceutical公司，姜黄素购自AnHui New Star Pharmaceutical Development公司，抗p-AMPK，抗AMPK和抗p-ACC抗体购自Cell Signaling Technology公司，抗β-actin、抗Nrf2、抗Keap1、抗HO-1、抗SREBP1、抗SREBP2和抗adipose differentiation related protein (ADRP)、抗血管内皮生长因子(VEGF)、抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 动物分组本次动物实验均经过动物伦理委员会同意。在自然生长第25周取30只动物随机分为3组：10只雄性Long-Evans-Tokushima-Otsuka大鼠作为正常对照组(CON组)，20只雄性OLETF大鼠平均分为糖尿病(DM)组和姜黄素处理(CUR)组。将大鼠饲养在恒温20℃～22℃、湿度50%～60%环境中，每天12 h光照，12 h黑暗，喂养水和标准大鼠饲料。25～45 w期间CUR组大鼠用姜黄素灌胃，剂量为100 mg·kg-1·d-1；DM组以同样剂量和方式灌胃生理盐水。为创建T2DM模型诱导高血糖和糖尿病，用30%蔗糖溶液喂养DM组和CUR组。

1.3 方法

1.3.1 标本采集大鼠在45 w时禁食过夜，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉。通过心脏穿刺取血，置于用乙二胺四乙酸钠处理过的小管中，在大鼠死亡前，用生理盐水灌注并除外左肾。离心血液，将澄清的血浆储存在-80℃冰箱中。去除肾脏以及附睾脂肪，左肾用液氮快速冷冻。一部分右肾用4%多聚甲醛固定48 h，用石蜡包埋用于组织学观察。剩余部分右肾用3%戊二醛在4℃下处理24 h用于超微结构研究。用DRI-CHEM 3500i检测血脂。

1.3.2 血糖和胰岛素水平检测分别在25 w和45 w检测体重和血糖水平，并且腹腔注射葡萄糖行耐受实验(IPGTT)以及静脉注射胰岛素耐受实验(IVITT)。胰岛素抵抗指标计算公式：血浆葡萄糖消失速率常数(Kitt)=0.693/T1/2×100。胰岛素抵抗稳态模式评估(HOMI-IR)=空腹胰岛素(FIN,μU/ml)×空腹葡萄糖(FBS,mmol/ml)/22.5。胰岛素分泌(HOMI-β)=20×FIN(μU/ml)/FBS(mmol/L)-3.5。

1.3.3 丙二醛(MDA)实验用高效液相色谱检测MDA，先用0.1125N PCA和40 mmol/L 2-硫代巴比妥酸处理尿液样品，97℃加热1 h形成衍生物。然后将溶液放在冰上20 min终止反应，20 min之后加入甲醇和20%三氯乙酸缓冲液。将样品震荡混合并且13 000 r/min离心6 min。取上清在荧光检测器下读数，激发波长为525 nm，发射波长为560 nm。

1.3.4 酶联免疫吸附(ELISA)实验收集24 h尿液检测白蛋白、肌酐和尿中SOD。血浆中FIN、脂联素和游离脂肪酸(FFA)检测用ELISA试剂盒。

1.3.5 肾皮质组织学观察用切片机将石蜡包埋的组织切为5 μm厚度薄片，之后用苏木精-伊红(HE)染色，用光学显微镜以及摄像系统观察切片。每张切片随机选择10个正切的肾小球，检测肾小球平均截面积(MGA)，取其平均值作为每个标本的MGA ，根据肾小球平均面积计算肾小球体积(MGV)，MGV=1.25×(MGA)3/2 。

1.3.6 透射电镜观察肾小球肾组织先用4%多聚甲醛固定，然后用2%锇酸(pH7.4)固定(4℃)，用乙醇丙酮梯度脱水，EDPON-816 环氧树脂包埋，将样品制备成为超薄切片，铀-铅双重染色，透射电镜观察肾超微结构，分析肾小球足细胞足突之间裂孔数量以及肾小球基底膜厚度。

1.3.7 Western印迹实验选取20 mg肾脏组织加入400 μl RIPA裂解液，用匀浆机将组织匀浆，13 000 r/min离心13 min并取上清。BCA工作液根据BSA(0.5 mg/ml)制备标准曲线，检测不同处理细胞蛋白浓度，制备上样蛋白(40 μg)。在8% SDS-PAGE凝胶中分离，之后电转到PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂牛奶室在室温封闭1 h，PBS洗3次，5 min/次，之后孵育相应抗体。在4℃环境下过夜，PBS洗3次，5 min/次。孵育相应的二抗，PBS洗3次，5 min/次。在膜上均匀撒ECL化学发光液后在化学发光成像系统中显影。

1.3.8 肾皮质中TG含量测定主要检测溶解细胞之后水解TG分子释放的甘油，TG的浓度根据甘油的检测值计算。

1.4 统计学分析采用SPSS17.0软件行ANOVA或者重复测量的ANOVA检验t检验分析两组之间的差异。用GraphPad Prism5.0进行统计作图。

2 结果

2.1 姜黄素对FBS和FIN水平的影响与CON组相比，DM组显著升高FBS，并且显著降低FIN水平。DM组Kitt值、HOMA-β低于CON组(P<0.05)。3组HOMA-IR水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。DM组与CON相比，IVITT和IPGTT差异有统计学意义(P<0.05)。然而，DM组和CUR组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

表1 各组血糖和胰岛素水平检测

与CON组比较：1)P<0.05

2.2 姜黄素对尿白蛋白排泄和尿白蛋白肌酐比值水平影响在45 w时，DM组24 h尿白蛋白排泄〔(28.67±5.11)mg〕和尿白蛋白肌酐比值〔(3.49±1.85)mg/mg Cr〕与CON组〔(1.56±0.18)mg,(0.13±0.05)mg/mg Cr〕相比差异显著(P<0.05)；而CUR组〔(11.24±2.03)mg,(1.56±1.12)mg/mg Cr〕与DM组相比，其可显著降低尿白蛋白排泄和尿白蛋白肌酐比值(P<0.05)。

2.3 姜黄素对肾小球损伤的影响 HE染色可见，DM组肾小球肥大，姜黄素处理之后可减轻DM所引起的肾小球肥大。与CON组〔(0.84±0.19)μm3/106〕相比，DM组肾小球体积〔(1.40±0.16)μm3/106〕增加，姜黄素处理之后可减少肾小球体积〔(1.12±0.12)μm3/106〕。与CON组〔(138.26±21.26)nm〕相比，DM组肾小球基底膜厚度〔(190.13±19.54)nm〕增加，同时DM组足细胞足突融合。DM组肾小球基底膜上足细胞足突之间裂孔数量〔(1 206.64±221.96)个〕与CON组〔(2 315.58±249.88)个〕相比明显减少(P<0.05)。姜黄素处理之后可逆转DM引起的基底膜厚度增加与裂孔数量减少〔(155.34±15.56)nm,(1 603.22±236.43)个〕。见图2。

与CON组比较：1)P<0.05 图1 各组IVITT和IPGTT结果

图2 姜黄素对肾脏组织形态变化的影响

2.4 姜黄素对氧化应激的影响在收集的24 h尿中，与DM组〔(6.87±1.12)U/ml〕相比，姜黄素处理之后可显著升高SOD水平〔(10.16±1.23)U/ml,P<0.05〕，CON组尿SOD水平为(8.35±0.81)U/ml。与CON组〔(2.49±1.24)μmol/g Cr〕相比，DM组MDA水平〔(6.68±2.98)μmol/g Cr〕显著升高(P<0.05)；姜黄素处理之后，MDA水平显著降低〔(4.06±1.14)μmol/g Cr,P<0.05〕。Nrf2/Keap1与HO-1蛋白表达在姜

黄素处理之后显著升高(1.62±0.24，1.37±0.38)，与DM组(0.38±0.14，0.60±0.12)相比差异有统计学意义(P<0.05)。CON组Nrf2/Keap1、HO-1蛋白表达水平分别为0.98±0.13，0.99±0.13，见图3。

2.5 姜黄素对体重和脂质相关靶分子水平的影响表2可见，在姜黄素处理之前，即起始体重DM组、CUR组与CON组相比差异有统计学意义(P<0.05)；而三组最终体重无显著差异(P>0.05)。DM组与CUR组肾脏重量与体重比显著高于CON组(P<0.05)。CUR组附睾脂肪重量与体重的比值与CON组相比显著减少(P<0.05)。将脂联素值除以附睾脂肪重量与体重相比的比值，CUR组所得数值显著高于DM组(P<0.05)。CUR组含量显著高于CON组(P<0.05)。姜黄素处理之后，CUR组TG含量显著减少，与DM组相比差异有统计学意义(P<0.05)。DM组中AMPK蛋白磷酸化(p-AMPK)与ACC磷酸化(p-ACC)表达减少，与CON组相比差异有统计学意义(P<0.05)；而姜黄素处理之后发生逆转，p-AMPK与p-ACC表达减少(P<0.05)。DM组中SPEBP-1和SREBP-2蛋白表达较CON组增加(P<0.05)，而姜黄素处理之后显著抑制SPEBP-1和SREBP-2蛋白表达(P<0.05)。同样，ADRP蛋白在DM组中表达增加，姜黄素处理之后可降低ADRP的表达(P<0.05)。见图4。

图3 姜黄素对肾皮质中Nrf2/Keap1和HO-1蛋白表达的影响

组别起始体重(g)最终体重(g)左肾重量/体重附睾脂肪重量/体重脂联素(μg/ml)脂联素(μg/ml)/附睾脂肪重量/体重比值TC(mg/dl)TG(mg/dl)CON组46075±387254386±5091025±002234±026761±106325±0367903±14196188±1515DM组61466±60521)58022±7032038±0071)193±059541±1411)271±066100±17751)178±30841)CUR组61089±42291)55042±9033040±0071)163±0661)539±1881)386±1092)8477±995135±44251)2)

与CON组比较：1)P<0.05；与DM组比较：2)P<0.05

3 讨论

DN在临床上主要表现为蛋白尿、肾小球基底膜增厚和足细胞足突裂孔数量减少。另外，通过检测SOD和MDA以及Nrf2信号相关分子证明DM诱导的氧化应激，AMPK信号相关蛋白脂质分子改变可以提示异常的肾脏脂质代谢，然而所有的这些异常改变都可以被姜黄素逆转。

活性氧(ROS)在DN病理生理学改变中发挥着关键的作用〔15〕。高血糖能够诱导ROS产生和脂质过氧化，进而发展成为DN〔16〕。研究发现姜黄素能够增加尿液中SOD，与此同时，姜黄素可减少尿液中MDA。DN中，Nrf2表达减少，氧化应激增加，Keap1通过Nrf2负性调节有助于增加氧化应激〔17〕。DN肾脏皮质中HO-1表达减少可能与Nrf2降低诱导产生ROS有关〔18〕。姜黄素通过上调Nrf2表达进而增加HO-1表达，Nrf2激活可抑制T2DM肾脏脂质积累〔19〕。

姜黄素还可以通过脂质代谢影响DM并发症。已有研究报道姜黄素能够改善高脂血症〔20〕，降低TC、TG水平可能与降低DN有关。T2DM中高TC、高TG和高FFA会导致脂肪在器官中异常累积，当脂肪累积在肾脏中就可能导致慢性肾病〔21〕。在DM组中P-AMPK减少，姜黄素处理之后激活AMPK磷酸化，说明姜黄素可能调控AMPK活性。SREBP-1促进FFA合成〔22〕，SREBP-2促进胆固醇合成〔23〕，在DM肾脏组织中，两种蛋白表达升高，当姜黄素处理之后降低SREBP-1和SREBP-2蛋白表达。ADRP是脂滴标记物，在糖尿病组中表达上调，而姜黄素处理之后下调ADRP表达。AMPK调控脂肪酸关键通路是ACC磷酸化，ACC逆转乙酰辅酶A成为丙二酰辅酶A，阻止脂肪酸氧化。姜黄素使ACC磷酸化，抑制脂肪酸转运以及氧化。本研究发现涉及姜黄素抑制DN可能的机制是通过AMPK调控脂质合成。总之，姜黄素能够降低血清中TG、TC以及FFA，并且通过AMPK通路降低脂质积累。姜黄素通过Nrf2通路缓解肾小球病理生理改变以及氧化应激。本研究结果表明姜黄素在DN中发挥保护作用可能是通过抗氧化和脂质代谢，从而实现缓解病情。

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