吴媛媛

(沧州市中心医院肿瘤内科，河北 沧州 061000)

Keap1/Nrf2信号通路对人肺鳞癌细胞生长、转移和耐药的影响

吴媛媛

(沧州市中心医院肿瘤内科，河北 沧州 061000)

目的 探讨Keap1/Nrf2信号通路对人肺鳞癌细胞株H520生长、转移和耐药的影响。方法 使用慢病毒转染体系建立稳定高表达Keap1的H520细胞株模型(H520-Keap1)，同时以Keap1失活的细胞株(H520-GFP)为阴性对照组；采用Western印迹法检测各组细胞中Keap1、Nrf2蛋白表达，RT-PCR检测Keap和Nrf2下游靶基因mRNA表达；通过SRB比色法、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、体外细胞药敏实验分别检测各组细胞生长、转移和耐药情况。结果 H520-Keap1细胞中Keap1蛋白表达量明显高于H520-GFP细胞，Nrf2蛋白表达量明显低于H520-GFP细胞(P<0.01)。H520-Keap1细胞中Keap1 mRNA表达量明显高于H520-GFP细胞，H520-Keap1细胞中Nrf2下游靶基因Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm mRNA相对表达量明显高于H520-GFP细胞(P<0.01)。SRB比色法检测显示，第1～3天，H520-GFP与H520-Keap1细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)；第4天起H520-Keap1细胞增殖率明显低于H520-GFP(P<0.05)。H520-GFP细胞迁移率明显高于H520-Keap1细胞(P<0.01)；H520-GFP细胞的侵袭数明显高于H520-Keap1细胞(P<0.01)。H520-Keap1细胞对卡铂、吉西他滨的敏感性增加。结论 Keap1过表达可影响人肺鳞癌H520细胞中Nrf2及其下游靶基因表达，抑制癌细胞生长和转移，提升对卡铂和吉西他滨的敏感性。

肺鳞癌；H520细胞；Keap1；Nrf2

肺鳞癌约占肺癌总数的80%，化疗药物耐受性是治疗失败的主要原因〔1〕。Keap1/Nrf2信号通路在细胞氧化应激中发挥关键作用〔2〕。研究发现，肿瘤发展过程中该信号通路发挥两种不同作用，Nrf2可预防肿瘤产生，但在已形成的肿瘤组织中Nrf2异常表达会促进肿瘤生长〔3〕；Keap1是Nrf2的内源性酶抑制剂，可调控Nrf2的表达水平〔4〕。目前，Keap1/Nrf2信号通路对肺鳞癌细胞增殖、迁移、耐药方面影响的研究鲜有报道，本研究旨在探讨Keap1/Nrf2信号通路对肺鳞癌细胞生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肺鳞癌细胞株H520购于上海桑戈生物科技有限公司；真核重组质粒pGFP、pm Keap1-GFP购于上海舜百生物科技有限公司；DMEM细胞培养基、胎牛血清购于美国Amresco公司；一抗Keap1、Nrf2、β-actin购于上海钰博生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购于北京博然一新科技有限公司；SYBR Green试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司；卡铂、吉西他滨购于齐鲁制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 取对数期人肺鳞癌细胞H520，分为：①未转染组；②阴性对照组：转染慢病毒载体质粒pGFP(Lv-GFP)；③研究组：转染过表达Keap1慢病毒载体质粒(Lv-Keap1)。取对数生长期H520细胞，接种于6孔板中，每孔根据病毒感染效率加入病毒液。加5 μg/ml溴化乙二甲铵，5 h后加血清，36 h后更换培养基，继续培养60 h后荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.2 Western印迹检测 收集3组细胞，蛋白裂解后行蛋白定量，取50 μg蛋白，滴加上样缓冲液，沸水浴加热使蛋白变性后，电泳、转膜、BSA封闭，滴加1∶1 000稀释的Keap1、Nrf2、β-actin单克隆抗体，孵育过夜，加HRP标记的二抗，曝光后检测3组细胞中Keap1、Nrf2蛋白表达情况。

1.2.3 RT-PCR检测 提取3组细胞总RNA，逆转录得到cDNA，-20℃保存；Keap1和Nrf2下游靶基因(Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm)引物序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成；RT-PCR总反应体系30 μl(上、下游引物各1 μl，cDNA 0.5 μl，Taq酶15 μl，双蒸水12.5 μl)；反应条件：95℃变性20 min，93℃ 40 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共40个循环。

1.2.4 SRB比色法检测3组细胞的增殖情况 取对数生长期3组细胞，按每孔2 000个细胞接种到96孔板中，每孔加入含胎牛血清的DMEM培养液150 μl，孵育24 h，10%三氯乙酸固定90 min，蒸馏水冲洗；每孔加入5 mg/ml的SRB溶液50 μl，室温下静置30 min，1%冰醋酸冲洗；每孔加入5 mmol/L的Tris，振荡至晶体完全溶解，读取510 nm波长处的吸光度值，设置3个复孔。

1.2.5 体外细胞迁徙和侵袭实验 取对数期H520-GFP、H520-Keap1细胞，按1×106/孔的密度接种到6孔板中，培养24 h后在细胞表面用无菌注射器针头制造划痕，洗去漂浮细胞，加入不含血清的DMEM培养基拍照，培养24 h后拍照，比较细胞迁移率。将H520-GFP、H520-Keap1细胞以相同密度接种Transwell小室，含血清的DMEM培养基150 μl，下室加入500 μl无血清培养基，孵育24 h，结晶紫染色40 min，除去上室细胞，磷酸缓冲液冲洗，光学显微镜下随机选取3个视野行细胞计数并拍照。

1.2.6 体外细胞药敏检测 取对数期H520-GFP、H520-Keap1细胞，2 000 r/min离心10 min，弃去上清，DMEM培养基重悬细胞，计数后按5 000个/孔密度接种到96孔板中，每孔滴加150 μl细胞培养液，孵育24 h，加入不同浓度的吉西他滨、卡铂，设置3个复孔，继续培养48 h，SRB比色法检测细胞存活率，计算药物对细胞增殖的IC50。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 质粒转染人肺鳞癌细胞H520细胞情况 H520-GFP、H520-Keap1细胞转染效率均>90%，见图1。因Keap1蛋白主要在细胞质中表达，因此H520-Keap1细胞仅细胞质中存在绿色荧光。

图1 H520-GFP和H520-Keap1细胞转染效率(×200)

2.2 H520-Keap1细胞中Keap和Nrf2蛋白表达 H520-GFP、H520-Keap1细胞中Keap1蛋白表达量分别为(4.31±1.82)、(9.24±1.06)；Nrf2蛋白表达量分别为(7.35±1.51)、(3.82±0.94)。H520-Keap1细胞中Keap1蛋白表达量明显高于H520-GFP细胞，Nrf2蛋白表达量明显低于H520-GFP细胞(P<0.01)，见图2。

图2 3组细胞中Keapl和Nrf2蛋白表达情况

2.3 H520-Keap1细胞中Keap1 mRNA和Nrf2下游靶基因表达 H520-GFP、H520-Keap1细胞中Keap1 mRNA相对表达量分别为(1.17±0.31)、(7.69±1.44)，H520-Keap1细胞中Keap1 mRNA表达量明显高于H520-GFP细胞(P<0.01)。H520-Keap1细胞中Nrf2下游靶基因Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm mRNA相对表达量分别为(1.95±0.20)、(2.07±0.64)、(1.32±0.08)、(1.62±0.46)，明显高于H520-GFP细胞中的(3.95±0.73)、(5.67±0.41)、(3.61±0.39)、(4.38±0.66)(P<0.01)。

2.4 过表达Keap1对H520细胞增殖的影响 第1～3天，H520-GFP与H520-Keap1细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)；第4天起H520-Keap1细胞增殖率明显低于H520-GFP(P<0.05)，见表1。

2.5 过表达Keap1对H520细胞迁移和侵袭力的影响 划痕实验显示，24 h时H520-GFP细胞迁移率为(53.61±9.37)%，明显高于H520-Keap1细胞的(36.28±6.32)%(P<0.01)。Transwell侵袭实验显示，H520-GFP细胞的侵袭数(291.53±21.27)个/高倍镜视野，明显高于H520-Keap1细胞的(148.20±12.16)个/高倍镜视野(P<0.01)，见图3。

与H520-GFP细胞比较：1)P<0.05

图3 H520-GFP和H520-Keap1细胞侵袭能力(×100)

2.6 过表达Keap1对H520细胞化疗药物敏感性的影响 卡铂、吉西他滨分别作用48 h后空白对照组H520细胞生长良好，卡铂给药组和吉西他滨给药组均呈现剂量依赖的增殖抑制作用。其中卡铂对H520细胞、H520-GFP细胞、H520-Keap1细胞的IC50分别为(87.51±5.63)μmol/L、(106.70±11.87)μmol/L、(51.06±4.64)μmol/L；吉西他滨IC50分别为(9.43±0.51)μmol/L、(9.86±0.48)μmol/L、(6.72±1.16)μmol/L，提示过表达Keap1的H520细胞株对卡铂、吉西他滨的敏感性增加。

3 讨 论

细胞抗氧化反应过程中Nrf2发挥中枢调节作用，是细胞正常状态下抵抗外界不良刺激所产生的保护性应激反应的重要调控因子〔5〕。Keap1是Nrf2的内源性酶抑制剂，细胞质中Keap1与Nrf2结合后可介导其降解；但细胞处于氧化应激状态

时，亲核试剂和应激源作用于Keap1，诱发其构象改变，Keap1与Nrf2相互解离后失去介导Nrf2降解的活性，引发胞内Nrf2高表达〔6〕。中国目前对晚期肺鳞癌的治疗仍首选化疗，但耐药性的产生常导致治疗低于预期。相关研究显示，癌细胞中因Keap1突变导致细胞核中Nrf2大量积累，Nrf2表达水平上升，会增加二相解毒酶、抗氧化酶基因、药物泵基因等Nrf2调控的下游基因表达水平，加速抗肿瘤药物在胞内的代谢速度，产生肿瘤细胞耐药性〔7〕。研究发现，人卵巢癌细胞株对顺铂、奥沙利铂的耐药性与Nrf2表达水平呈明显正相关〔8〕。本研究结果显示，过表达Keap1可明显提升H520细胞对卡铂、吉西他滨的敏感性，可为提升肺鳞癌化疗效果提供新的途径。

1 周风举，姜丽真，卢海燕，等.老年肺癌患者化疗期间并发感染的高危因素〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(19)：5540-1.

2 王大朋.Keap1-Nrf2/ARE信号通路在砷致HaCaT细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究〔D〕.苏州：苏州大学，2015.

3 Koenigkam Santos M，Muley T，Warth A，etal.Morphological computed tomography features of surgically resectable pulmonary squamous cell carcinomas：impact on prognosis and comparison with adenocarcinomas〔J〕.Eur J Radiol，2014；83(7)：1275-81.

4 张逸平，李正祎.IL-24联合大蒜素体外抗肺癌细胞生长的实验研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2016；17(3)：335-8.

5 Zhu YJ，Xu B，Xia W，etal.Hsa-mir-182 downregulates RASA1 and suppresses lung squamous cell carcinoma cell proliferation〔J〕.Clin Lab，2014；60(1)：155-9.

6 杨励励.2010-2013年锦州市居民恶性肿瘤死亡原因分析〔J〕.中国卫生工程学，2016；15(1)：75-6.

7 Fode MM，Hilberg O，Bendstrup E，etal.Squamous cell carcinoma of the lung in lung transplantation--A relation to human papilloma virus〔J〕?Acta Oncologica，2012；51(6)：812-3.

8 Kim MJ，Shin HC，Shin KC，etal.Best immunohistochemical panel in disting adenocarcinoma from squamous cell carcinoma of lung：tissue microarray assay in resected lung cancer specimens〔J〕.Ann Diagnost Pathol，2013；17(1)：85-90.

〔2016-12-11修回〕

(编辑 李相军/滕欣航)

沧州市科技技术局项目(162302040)

吴媛媛(1978-)，女，硕士，主治医师，主要从事肿瘤相关疾病的临床诊治研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2123-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.018