赵艳坤，邵 伟，余 雄

（新疆农业大学动物科学学院，新疆肉乳用草食动物营养实验室，新疆乌鲁木齐 830052）

脐带间充质干细胞对乳腺上皮细胞乳蛋白合成的调控研究

赵艳坤，邵 伟，余 雄*

（新疆农业大学动物科学学院，新疆肉乳用草食动物营养实验室，新疆乌鲁木齐 830052）

为探究脐带间充质干细胞（UC-MSCs）调控乳腺上皮细胞（BMECs）乳蛋白合成的可能作用机制，实验共分为8组，实验组利用Transwell小室双层共培养UC-MSCs和BMECs，BMECs单培养为对照组，每组又分为不处理组和IGF-Ι R抑制剂AG1024、PI3K抑制剂LY294002不同处理组，ELISA检测上清IGF-Ι和β-酪蛋白（CSN2）、κ-酪蛋白（CSN3）含量，实时荧光定量PCR测定CSN2、CSN3、P13K、AKT、mTORmRNA表达。结果表明：实验组各项指标均极显著高于对照组（P＜0.01）；AG1024处理显著下调各基因表达（P＜0.05），极显著降低CSN2、CSN3蛋白含量（P＜0.01）；LY294002处理极显著抑制PI3K mRNA表达（P＜0.01），显著降低CSN2、CSN3 mRNA表达和蛋白含量；AG1024 和LY294002共同处理极显著下调P13K、AKT、mTORmRNA表达（P＜0.01），显著下调CSN2、CSN3 mRNA表达（P＜0.05），极显著降低CSN2、CSN3蛋白含量（P＜0.01）。综上，UC-MSCs能够通过IGF-Ι介导PI3K/Akt/mTOR信号通路，上调BMECs主要乳蛋白基因表达，促进乳蛋白合成。

脐带间充质干细胞；乳腺上皮细胞；乳蛋白

乳腺上皮细胞（Bovine Mammary Gland Epithelial Cells, BMECs）是乳腺发育和分泌乳汁的执行者，体外分离培养BMECs能够合成和分泌乳蛋白。激素和细胞因子能够直接调节BMECs乳蛋白的生物合成和分泌[1]。酪蛋白是乳蛋白主要成分，β-酪蛋白、κ-酪蛋白的基因表达丰度关乎着其合成与分泌，是研究BMECs乳蛋白合成的标志[2]，而乳蛋白基因表达受多种激素或细胞因子与复杂信号转导系统协同调控[3]。近年来，越来越多的实验证明体外添加不同浓度类胰岛素样生长因子-Ι（Insulin Like Growth Factors-Ι, IGF-Ι）可单独或协同其他激素促进乳腺生长发育、乳蛋白基因表达，提高泌乳量[4-5]，并认为IGF-Ι通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥调控作用[6]。PI3K/AKT/mTOR信号通路包括PI3K、PTEN、AKT和mTOR等分子，受各种激素或因子刺激后，调控乳蛋白合成[7]。研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路控制着乳蛋白相关基因的翻译[8]，研究该通路对促进泌乳生物学发展具重要价值。但内源性IGF-Ι直接介导的PI3K/ AKT/mTOR信号通路在乳蛋白合成中的作用未见报道。该团队前期已成功构建UC-MSCs和BMECs无血清共培养体系，并进行了条件优化，发现UCMSCs可显著促进BMECs增殖、抑制其凋亡，且能够显著提高BMECs中IGF-I的表达分泌[9]。因此，本实验从模拟体内细胞因子调节乳腺泌乳的角度出发，通过UC-MSCs和BMECs共培养，探究内源性IGF-Ι对BMECs乳蛋白合成的影响及可能的作用途径，在细胞水平上探索乳腺泌乳功能的调控机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料 UC-MSCs为前期体外分离培养并鉴定的荷斯坦奶牛脐带间充质干细胞；BMECs购自广州吉妮欧生物科技有限公司；AG1024、LY294002购自于Sigma官网，Transwell小室、Elisa试剂盒购自于上海博谷生物科技有限公司。

1.2 实验设计与分组 在前期实验基础上，按照UC-MSCs和BMECs共培养最佳浓度比（1:2）和时间点（48 h），应用Transwell 小室（孔径0.4 μm）建立上下双层细胞共培养体系，在上室接种BMECs 1×105/孔1 mL，下室接种UCMSCs1×105/孔2 mL，48 h后分别给予IGF-Ι R抑制剂AG1024（AG, 10 μmol/L）、PI3K抑制剂LY294002（LY, 25 μmol/L）处理细胞24 h，无处理组加入等体积DMSO，吸取上清用于IGF-I、CSN2、CSN3含量检测，并采用胰酶消化法收集细胞，-20℃保存备用于荧光定量PCR基因表达检测。实验共分为8组： BMECs、BMECs/UCMSCs、BMECs+AG、BMECs/UCMSCs+AG、B M E C s+L Y、B M E C s/U C-M S C s+L Y、BMECs+AG+LY、BMECs/UC-MSCs +AG+LY，每组均3个平行处理，均置于37℃、5% CO2培养箱常规培养，培养液均为无血清基础培养基（Serum Free Medium，SFM）。

1.3 IGF-Ι、CSN2、CSN3含量测定 采用双抗体夹心法测定上述各组上清中IGF-Ι、CSN2、CSN3浓度水平，方法按照ELISA试剂盒（上海博谷生物科技有限公司）说明书进行。

1.4 基因转录相对定量测定 参照试剂盒说明书（LN-0108A，上海诺伦生物医药技术有限公司）提取各组细胞总RNA，全自动酶联免疫分析仪测出RNA浓度以及OD260/280，以提取的总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书（10 μL，37℃15 min、85℃ 5 s）合成cDNA。乳蛋白关键基因CSN2、CSN3和主要信号通路关键分子PI3K、AKT、mTOR基因序列均从GenBank中获取，引物用Primer5.0软件进行设计，由上海博古生物科技有限公司合成，引物信息详见表1。PCR按20 μL反应体系进行，反应条件为95℃ 30 s变性，95℃5 s，60℃ 31 s，50个循环，上机自动分析荧光信号并将其转换Ct值，采用 ΔΔCt法分析，以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参基因计算各目的基因mRNA相对定量值（2-ΔΔCt）。

1.5 统计分析 数据用SPSS 18.0软件进行ANOVA方差分析，差异显著时采用Duncan's法对各组间平均数进行多重比较，结果表示为平均值±标准差表示，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Elisa检测结果 实验组IGF-Ι含量极显著高于对照组（P＜0.01），AG1024处理组极显著降低IGF-Ι含量（P＜0.01），BMECs/ UC-MSCs+AG1024组IGF-Ι含量极显著高于BMECs+AG1024组（P＜0.01）（图1）；实验组CSN2、CSN3含量极显著高于对照组（P＜0.01），AG1024和LY294002处理组CSN2、CSN3的合成量均极显著低于处理前（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+AG组极显著高于BMECs+AG组（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+LY组极显著高于BMECs+LY组（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+AG+LY组显著高于BMECs+AG+LY组（P＜0.05）（图2）。

表1 引物序列

图1 AG1024对BMECs中IGF-I含量的影响

图2 AG1024和LY294002对BMECs中CSN2、CSN3合成量的影响

2.2 RT-qPCR鉴定结果 表2数据显示，各样本RNA浓度均在200～400 ng/μL，OD260/280均在1.8～2.2，表明总 RNA 纯度较高，并且有足量的RNA用于后续实验；各基因RT-qPCR扩增图谱显示（图3），Ct值是反映体系中荧光信号达到阀值时经历的循环数，熔解曲线显示（图3），基线平稳，表明PCR产物单一，能准确定量目的基因mRNA的表达量。

表2 各组细胞样品的总RNA浓度和纯度

图3 各基因扩增图谱和熔解曲线

2.3 AG1024和LY294002对乳蛋白合成和信号通路关键基因表达的影响 定量结果显示，实验组PI3K、AKT、mTORmRNA表达丰度均极显著高于对照组（P＜0.01），AG1024和LY294002处理组均极显著下调各项基因表达丰度（P＜0.01）（图4）；各组细胞中CSN2、CSN3mRNA的表达，实验组最高，显著高于对照组（P＜0.05），AG1024和LY294002单独处理组均显著低于处理前（P＜0.05），BMECs+AG+LY组较对照组相比极显著下调（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+AG+LY组较实验组相比显著下调（P＜0.05），不同处理方案的实验组均显著高于同处理的对照组（P＜0.05）（图5）。

3 讨 论

前期实验已证实，UC-MSCs、BMECs均可分泌IGF-Ι，无血清共培养条件下，UC-MSCs能够显著提高BMECs中IGF-Ι、IGF-Ι R mRNA表达。研究结果表明，UC-MSCs可分泌IGF-I等多种细胞因子，通过自分泌、旁分泌作用影响其他组织[10]；Tucker[11]研究发现，离体的BMECs能够分泌IGF-Ι，且能够表达IGF-Ι R。本实验ELISA结果显示，共培养后BMECs中IGF-Ι含量极显著高于单纯BMECs组，验证了与UC-MSCs共培养可提高BMECs的IGF-Ι表达分泌量，而本研究证实了Burgos等[12]外源添加IGF-Ι可促进BMECs乳蛋白合成的研究结果 。IGF-Ι R抑制剂显著抑制IGF-Ι、CSN2、CSN3合成的结果，进一步证明了IGF-Ι可促进BMECs合成酪蛋白。抑制剂处理后BMECs的CSN2、CSN3mRNA表达丰度和CSN2、CSN3合成量相吻合。王浩宇等[13]研究发现，BMECs的CSN2 mRNA表达丰度随着IGF-I浓度的增加而上调；另有报道，IGF-Ι可提高BMECs的酪蛋白基因表达[14]，促进BMECs乳蛋白的合成。这些均与本实验结果一致，转录水平说明了IGF-Ι作为一种重要细胞因子参与了UCMSCs促进BMECs的CSN2、CSN3 mRNA表达，从而促进CSN2、CSN3蛋白含量增加，但不同之处在于本实验并非使用外源添加的IGF-Ι，而是利用Transwell小室判断UC-MSCs分泌的IGF-Ι对BMECs的作用，且采用的是无血清培养基，排出了其他外源因子的干扰，因此可以说UC-MSCs对BMECs乳蛋白合成的调控作用是由IGF-Ι参与得以实现。

图4 AG1024和LY294002对BMECs中PI3K、AKT、mTOR mRNA表达的影响

图5 AG1024和LY294002对BMECs中CSN2、CSN3mRNA表达的影响

本研究结果显示，与UC-MSCs共培养可以提高BMECs的PI3K、AKT、mTORmRNA表达，该表达可被抑制剂极显著下调，表明IGF-Ι通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥调节作用。研究发现，IGF-I与IGF-IR结合可活化PI3K、AKT和MAPK通路[15]；曾凡星等[16]给大鼠注射IGF-I明显促进mTOR及其上游信号AKT活性。本实验发现，阻断剂LY294002通过抑制PI3K下调了其下游信号分子AKT、mTOR的表达，且显著下调了BMECs中CSN2、CSN3的mRNA表达，当IGF-I和PI3K/AKT/mTOR信号通路同时被抑制时，极显著下调了BMECs的CSN2、CSN3 mRNA表达，而共培养的CSN2、CSN3的合成量以及CSN2、CSN3mRNA表达丰度较处理的BMECs显著升高，表明与UC-MSCs共培养可能是通过IGF-I重新激活BMECs中被阻断的PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进BMECs乳蛋白关键基因的表达，从而促进酪蛋白的合成。Morrison[17]通过实验证明，IGF-Ι在BMECs中是通过增强mTOR信号途径促进乳蛋白的表达合成；高海娜等[18]证明了mTOR可以提高CSN1S1和CSN2基因的表达，促进乳蛋白的合成。这提示来源于UC-MSCs的IGF-I与BMECs中IGF-IR结合活化了PI3K，激活下游信号分子AKT，活化的AKT引起mTOR的磷酸化，使整个PI3K/AKT/mTOR信号表达增强，从而参与对CSN2、CSN3mRNA表达的调控作用，促进BMECs中CSN2、CSN3的合成量。

乳蛋白的合成调控是一个极其复杂的过程，受多条信号通路的调控，且UC-MSCs可以分泌除IGF-Ι外的多种细胞因子，但本实验只是对IGF-I和PI3K/AKT/mTOR信号通路进行了检测，其他因子和信号途径是否参与并不可知，且本实验并未检测PI3K/AKT/mTOR信号通路的上游、下游及正向、负向调控分子，尚不足以揭示其促进乳蛋白合成的具体调控机理，需进一步研究探索。

4 结 论

本实验初步揭示了UC-MSCs对BMECs乳蛋白合成的可能作用机制，即UC-MSCs可能通过IGF-Ι介导PI3K/Akt/mTOR信号通路，上调BMECs中CSN2、CSN3的mRNA表达，促进CSN2、CSN3的合成。

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S823.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-055

2016-11-21；

2017-02-08

国家自然科学基金（31560645）；自治区科技人才培养项目（GN2015YX014）;中国博士后基金委；2015年度新疆研究生科研创新项目（XJGRI2015083）

赵艳坤（1990-），女，河南人，博士生，从事反刍动物营养研究，E-mail：452349621@qq.com

* 通讯作者：余雄，E-mail：yuxiong8763601@126.com