敖维平　张蕾　周东年　盛鹤

摘要：为筛选降解棉籽粕大分子蛋白有效菌株，试验选用假丝酵母菌（1630）、米曲霉（2174）、黑曲霉（2377）、混合菌（假丝酵母菌：米曲霉：黑曲霉=1：1：1）进行棉籽粕灭菌和未灭菌固体发酵。分别采用微量凯氏定氮法、甲醛滴定法测定棉籽粕发酵产品的酸溶蛋白氮、游离氨基氮，比较棉籽粕发酵产品的小分子肽氮含量、小分子肽氮提高率。结果表明，选用3株标准菌种及其混合菌液对棉粕发酵处理均可降解大分子棉蛋白，且混合菌株发酵表现出“协作效应”；由反映发酵棉蛋白特性的酸溶蛋白总氮、游离氨基氮、小肽含量可知，单菌株及混合菌株发酵处理时间以48 h为宜。

关键词：棉籽粕；酸溶蛋白氮；游离氨基氮；小分子肽氮

中图分类号：S816.43 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0366—03

棉粕是我国饲料工业中一种重要的蛋白质原料，常年生产量超过600万t，粗蛋白含量仅低于豆粕，但棉粕含游离棉酚、蛋白质品质差等不利因素限制了其在畜牧生产中的应用。对棉籽粕的开发利用中不仅要降低棉粕游离棉酚，提高棉粕蛋白质品质也极为重要。国内外学者采用有效菌种发酵改良棉粕营养特性，并取得了一定进展，发酵降低棉粕游离棉酚的研究较多，而关于发酵后棉粕蛋白质品质改良的研究仍有待深入。随着动物营养研究的深入开展，小肽营养逐渐成为动物营养的研究热点，利用低质饲料蛋白原料生产小分子营养肽备受关注，发酵法也成为降低蛋白分子质量、提高棉蛋白品质的有效方法。本研究选用黑曲霉、假丝酵母菌、米曲霉、混合菌液固体发酵降解棉粕，并分析棉粕发酵降解后的蛋白质组成特性，以期为棉粕在畜牧业生产中的合理利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

棉籽粕购自新疆维吾尔自治区阿拉尔市某油脂厂，经粉碎过40目筛，作为发酵基础原料。假丝酵母菌（1630）、米曲霉（2 174）、黑曲霉（2 377）标准菌种均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。PDA液体培养基配方为：马铃薯200 g/L、蔗糖20 g/L，pH值自然；LB液体培养基配方为：酵母膏5 g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0。

1.2试验方法

1.2.1种子液的制备 取超低温保存的菌种置于37℃使其解冻，挑取菌落并接种于液体培养基中，置于37℃使其复活，取复活的菌落进行2次以上斜面培养，获得斜面菌种。

假丝酵母菌：取1环活化并经培养的斜面菌种接于LB液体培养基中，于37℃、200 r/min摇床培养12 h后，取2 mL转接至另一LB液体培养基，并于37℃、200 r/min摇床培养12 h作为种子液。黑曲霉与米曲霉：取1环斜面菌种接于放有20颗玻璃株的PDA液体培养基中，于30℃、200 r/min摇床培养24 h后，取2 mL转接至另一PDA液體培养基，并于30℃、200 r/min摇床培养24 h作为发酵种子液。

1.2.2棉籽粕发酵处理 称取棉粕50 g置于500 mL三角瓶，按料水比1 g：1 mL充分搅匀，置于121℃高温高压灭菌30 min。试验发酵分为未灭菌发酵、灭菌发酵，分别接种酵母菌、黑曲霉、米曲霉、混后菌（酵母菌：黑曲霉：米曲霉=1：1：1），接种量均为100 g/L，对照组（0 h）以重蒸水代替菌液，分别于发酵24、48、72 h时取样，置于60℃烘箱12 h后，粉碎并过60目筛，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.3指标测定 称取过60目筛的发酵棉籽粉5 g，加入70 mL水并于恒温振荡器振荡3 h，加入20 mL体积分数为10%的三氯乙酸，过滤并用体积分数为10%的三氯乙酸定容至100 mL，将滤液于4 000 r/min离心10 min，取上清液作为测定分析样品。

发酵前棉粕蛋白氮、发酵棉粕酸溶蛋白总氮均采用凯氏定氮法测定；游离氨基氮采用甲醛滴定法测定。小分子肽氮含量（mg/g占干基）：酸溶蛋白氮与游离氨基氮之差。

小分子肽氮提高率=（发酵后小肽氮-发酵前小肽氮）×100%÷发酵前小肽氮。

1.3数据分析

采用Excel 2007软件进行数据整理，采用DPS软件进行完全随机单因素分析，采用LSD软件进行多重比较，数据以“平均值±标准差”表示。

2结果与分析

2.1黑曲霉发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性

由黑曲霉发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性（表1）可知，发酵处理棉籽粕后，酸溶蛋白总氮、小肽氮含量、小肽氮提高率均高于发酵前，且发酵48h时小肽氮含量均达到最大值，48 h后呈降低趋势，这与李全丰等的研究结论相似。试验结果表明，黑曲霉对灭菌、未灭菌的棉籽粕蛋白均有降解作用，且小分子肽氮含量显著提高。

2.2假丝酵母发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性

由假丝酵母发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性（表2）可知，假丝酵母发酵棉蛋白后，酸溶蛋白总氮含量、小肽氮含量、小肽氮提高率均高于发酵前，而游离氨基氮则呈降低趋势，与黑曲霉发酵棉粕游离氨基氮的趋势相反。试验结果表明，假丝酵母具有降解大分子棉蛋白的作用。

2.3米曲霉发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性

由米曲霉发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性（表3）可知，米曲霉发酵棉蛋白后，酸溶蛋白总氮含量、小肽氮含量均高于发酵前，并随发酵时间的推移呈上升趋势，但发酵48 h后呈下降趋势；发酵棉蛋白的游离氨基氮较发酵前均减少。

2.4混菌发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性

由混菌发酵前后棉籽粕产品的蛋白质特性（表4）可知，混合菌种发酵棉蛋白后，酸溶蛋白总氮含量、小肽氮含量均高于发酵前，并随发酵时间的推移呈上升趋势，但发酵48 h后呈降低趋势；混菌发酵棉粕蛋白的小分子肽氮含量最佳，而游离氨基氮均低于发酵前。试验结果表明，混菌发酵降解棉粕大分蛋白的效果优于单菌种发酵。

2.5不同菌种降解棉粕产生小分子肽的效果

由不同菌种降解棉粕大分子蛋白质产生小分子肽的效果（图1、图2、表5）可知，采用3种菌株及其混合菌液发酵处理均可不同程度降解棉粕大分子蛋白质，且灭菌发酵与未灭菌发酵的变化趋势相似，除假丝酵母菌外，多以发酵48 h产生的小分子肽氮含量最多。然而菌种之间仍存在差异，以混菌发酵产生的小肽氮含量提高最为明显，可见菌株混合发酵对降解棉粕大分子蛋白质具有“协同效应”，这与诸葛斌等的研究结论[2，4]一致。对单菌种的发酵效果进行比较，米曲霉最佳，黑曲霉次之，假丝酵母最差。

3结论与讨论

棉粕是优质蛋白质原料之一，尤其在我国主要产棉地区。然而，产棉地区棉粕在畜禽饲料中的利用比例有限，这与棉粕游离棉酚的毒性、棉蛋白的吸收利用率有关。采用有益菌株发酵法降解不易被利用的棉粕大分子蛋白，提高可直接吸收利用的小肽含量，已成为提高棉蛋白消化吸收利用率的一种有效方法。本试验选用3种工业微生物标准菌种及其混合菌液固体发酵处理棉粕，酸溶蛋白总氮、小分子肽含量均大幅提高。综合分析表明，3个菌株混合发酵的效果最佳，小分子肽氮可提高至6.37 mg/g（若蛋白系数取6.25，小肽含量可提高3.98%），比诸葛斌等的试验结果低，而比李旺军等的试验结果高，这可能与发酵选用的菌株和发酵底物有关。本试验以单一棉粕为发酵底物，比较灭菌发酵与未灭菌发酵对降解棉粕大分子蛋白的效果。结果表明，发酵前未灭菌棉粕的小肽氮含量很低，仅为0.24 mg/g，而高温灭菌使小肽氮含量提高至2.24 mg/g；高温灭菌使酸溶蛋白总氮增加，而使游离氨基氮降低，可能由于高温灭菌使部分大分子蛋白质肽键断裂而形成小分子肽，因游离氨基酸发生“美拉德反应”导致游离氨基氮减少。比较灭菌与未灭菌发酵对小肽氮提高率的影响可知，未灭菌发酵降解棉粕大分子蛋白质的效果优于灭菌发酵，但灭菌发酵的小肽氮含量较高。

试验采用3株标准菌种对棉粕发酵处理，均有降解大分子棉蛋白的作用，且混合菌株发酵表现出“协作效应”。由反映发酵棉蛋白特性的酸溶蛋白总氮、游离氨基氮、小肽含量可知，单菌株及混合菌株的发酵处理时间以48 h为宜。