张湾+孙璐璐+赵晓祥

摘要：通过浓度梯度驯化，从活性污泥中分离到1株颜料红23高效脱色菌ZW 4，根据其形态学特征及16S rRNA基因序列分析，鉴定该好氧菌株为原壁菌（Prototheca sp.）。研究脱色菌ZW 4好氧条件、120 r/min对颜料红23最适的脱色条件。结果表明，菌株最适宜的脱色条件为酵母粉浓度为1.0%、接种量为5%、pH值为7.5、温度为35℃、盐度小于2%，在此条件下，将浓度为100 mg/L的颜料红23溶液好氧培养18 h，脱色率接近90%。对ZW4降解产物进行紫外光谱分析发现，菌株脱色机制主要为生物降解脱色；经毒性试验表明，脱色后的颜料红23毒性明显降低。

关键词：颜料红23；分离；鉴定；生物脱色；毒性试验

中图分类号：X172；X703 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0357—05

颜料生产是精细化工生产的重要门类之一，无论是有机颜料还是无机颜料，在其生产过程中均会产生对环境造成严重污染的废水。有机颜料已普遍用于油墨、涂料、橡胶制品、塑料制品、文教用品和建筑材料物的着色，还用于合成纤维原浆着色和织物染料印花，是市场覆盖面很大的化工产品。偶氮颜料是有机颜料中品种最多、产量最大的一类，研究和解决偶氮颜料生产废水的处理方法，可以解决大部分颜料化工厂的废水治理问题，具有很强的代表性。偶氮颜料与偶氮染料的分子结构类似，具有相同的水质特征，而偶氮染料是染料分子中含有偶氮基（—N=N—）结构的统称，主要污染因子为CODcr、色度、苯胺。很多偶氮颜料是以致癌芳香胺作为合成中间体的，其中色酚AS-D、AS-E、AS-OL和AS-TR作为红色有机颜料的偶合组分，检测时受还原剂作用使偶氮键断裂，受高温影响而导致2-羧基3-萘甲酰芳胺水解，产生邻甲苯胺、对氯苯胺、邻氨基苯甲醚和4-氯-2-甲基苯胺等致癌芳胺。陈荣圻列举出一系列致癌芳胺的有机颜料，颜料红23的分子式虽与报道中的颜料红17仅有1个化学基团的差异，但颜料红23尚未被列入禁用偶氮颜料的目录中。致癌芳香胺的发现促使颜料品种研发朝环保型方向发展，但是由于高牢度、高环保型颜料制作成本较高，使不少中小型印花厂望而却步，非环保型偶氮颜料在市场上的应用仍占主要地位。

微生物具有繁殖速度快、适应性强等特点，利用高效脱色微生物进行环境污染治理，不仅成本低，而且可减少二次污染，被认为是染料脱色和降解最经济有效的方法。人工方法筛选对染料具有较强降解能力的高效菌，成为人们关注和研究的热点。目前，选育和培育优良的脱色菌株或菌群是染料脱色降解的一个重要发展方向，具有重要的现实意义，已有很多关于脱色降解偶氮染料细菌、真菌、藻类等生物的报道，而对色酚类偶氮颜料微生物降解脱色的研究国内尚未见报道。由于偶氮颜料不溶于水而只能溶于有机溶剂，本试验在筛选出对颜料红23具有高效脱色能力菌株的基础上，参考胡生等研究方法，选定6 mL/g二甲基亚砜为最佳有机溶剂，研究菌株对颜料红23的脱色条件及性能，以期丰富偶氮颜料降解菌的理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 活性污泥，来源于上海市松江污水处理厂二沉池；好氧污泥，取自序批式活性污泥法（SBR）反应器，由活性污泥经10 mg/L颜料红23废水驯化3～4周。

1.1.4主要仪器 BXM-30R型立式压力蒸汽高压灭菌锅、PYX-DHS·400-BS型隔水式热恒温培养箱、SPH-2102C型立式双层摇床、VS-840-1型超净工作台、UV-1800PC型紫外可见分光光度计、雷磁PHS-3c型pH计、BSAl24S型电子分析天平、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱、CT14RD型台式高速冷冻离心机、Eclipse 80i型荧光显微镜。

1.2菌株分离、鉴定与菌液制备

1.2.1菌株的分离筛选 取1 mL SBR混合废水上清液，加入到装有100 mL富集培养基的250 mL三角瓶中，30℃恒温振荡培养12 h；采用相同的方法，接种1代培养液1 mL至新鲜的富集培养基中进行振荡培养，使样品中的好氧菌群得到富集和活化；分装100 mL 20 mg/L含颜料的筛选培养基于250 mL锥形瓶中，接种1mL第l代活化菌液，筛选培养3～5 d；逐步增加筛选培养基中颜料的质量浓度，浓度梯度依次为20、40、60、80、100 mg/L，对混合菌液连续筛选培养5代，直至颜料红23的最终浓度为100 mg/L；取最后1次筛选培养基中的液体1 mL按梯度稀释，涂布于固体分离培养基平板上，30℃培养1～2 d；挑取有脱色圈且菌落明显的菌株进行反复划线，分离获得纯菌株；将单菌落挑取到含颜料的富集培养基中培养，不同时间段测定脱色率，选取具有最强脱色能力的菌株进行纯化，保存备用。

1.2.2菌株鉴定 菌株形态特征和生理生化特性的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》进行；菌株ZW 4基因组DNA提取及测序分析委托上海基康生物技术有限公司进行，并在NCBI中与相关的16S rRNA序列进行同源性比较，采用Mega程序构建系统发育树。

1.2.3菌液的制备 将菌株接种于100 mL富集培养基中，30℃、120 r/min摇床扩大培养；取适量菌液于无菌离心管中，6 000 r/min离心10 min；收集菌体，无菌水洗滌菌体，重复操作3次；以等体积的无菌生理盐水重悬。

1.3测定分析方法

1.3.1菌株的生长曲线及颜料降解曲线测定 将活化后的菌液按接种量10%接种到含有100 mg/L颜料红23的筛选培养基中，30℃、120 r/min摇床扩大培养，18 h内按10个时间点分别取样；以液体筛选培养基为空白对照，测定菌液在波长为600 nm处的吸光度；重复3次，取平均值，得到菌株的生长曲线。同样时间点取10 mL菌液，离心；以液体筛选培养基作为空白对照，在波长为579 nm处测定颜料红23的剩余吸光度，计算降解率；重复3次，取平均值，得到颜料的降解曲线。

1.3.2染料脱色影响因素研究 选取营养源、营养源浓度、接种量、pH值、温度、盐度作为主要考察因子。在含颜料的无机盐培养基中分别加入葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素共计7种营养源，含量均为1%；加入10 mL菌液，30℃、120 r/min摇床扩大培养，一定时间后测脱色率；将试验得到的最佳营养源添加到含颜料的无机盐培养基中构成脱色培养基，研究其他各影响因素对颜料脱色效果的影响，仅对1个因子设置不同的影响梯度，其他最佳因素保持不变；均设置3组平行试验。

1.3.3脱色率计算 菌株对颜料的脱色能力采用脱色率表征。取10 mL反应液，10 000 r/min离心6 min，取上清液于颜料最大吸收波长579 nm处测定吸光度D_t，以不接菌、含相同浓度颜料培养基的吸光度D。为对照，计算脱色率η，公式为：

1.3.4颜料脱色前后毒性测试 选取小麦和菜豆为试验材料，将颗粒饱满、大小均匀的种子放置于培养皿中，用自来水冲洗2～3次；用2%H₂O₂消毒15 min，再用自来水清洗数次，于30℃温水中浸种吸胀30 min；培养皿内放人等直径滤纸2张作为发芽床，每个发芽床上摆放20粒种子，光照培养箱中于25℃培养，每组3个重复，为保证种子发芽条件的适宜，必要时适当补充相应溶液以保持水分，同时将感染霉菌的种子及时用蒸馏水冲洗；培养2、4、6、7、9 d，分别调查种子的发芽率，测量胚根、胚芽长度，选择测量数据中最有规律的1组作为有效数据。

2结果与分析

2.1菌株的分离筛选

分离得到4株对颜料红23有脱色能力的菌株见图2，其外形特征为：菌株ZW1的菌落呈红色且不透明，边缘整齐，表面光滑；菌株ZW2的菌落呈白色且不透明，圆形且较湿润，边缘整齐，不易挑起；菌株ZW3的菌落呈黄色且不透明，边缘整齐，表面光滑；菌株ZW4的菌落为圆形、较小、扁平且有光泽，中央突起，边缘整齐，表面光滑，菌落呈乳白色且不透明，易挑起。由表1可见，菌株ZW4在同一时间测得的脱色率最高。因此，后续试验选取脱色性能最好的菌株ZW4作为目标菌株。

2.2优势菌株ZW4革兰氏染色及生理生化特性

由图3可见，优势菌株ZW4的革兰氏染色为紫色，其为革兰氏阳性菌。菌株ZW4经葡萄糖发酵试验产酸不产气，经乙酞甲基甲醇、明胶液化、吲哚、尿素水解试验检测均为阴性，经苯丙氨酸脱氢酶、淀粉水解酶、过氧化氢酶试验检测均为阳性，经甲基红试验检测阴性、阳性均有。

2.3菌株的16S rRNA序列分析

由图4可见，菌株ZW4与Prototheca sp.的相似度最高，达到89.7%，而低于一般相似度的97.5%，为疑似新种，将菌株ZW4命名为原壁菌（Prototheca sp.）。

2.4菌株的生长曲线及颜料红23的脱色曲线

由图5可见，度过前4 h的适应期，菌体开始在培养基中快速生长，颜料的脱色与菌体生长同步；好氧培养8 h，菌体的D_600nm约达到0.59，此时颜料红23的脱色率达到70%以上；培养18 h，菌体对颜料红23的脱色率达到91.6%。结果说明菌株ZW4在含有颜料的培养基中能良好生长，且可对颜料红23进行有效脱色，是1株好氧条件下对颜料脱色能力较强的菌株。

2.5营养源对菌株ZW4脱色性能的影响

在没有外加营养源的情况下，菌株无法生长，菌株不能以颜料红23作为唯一碳源进行代谢。由图6可见，不同的营养源对菌株ZW4的脱色效果各异；脱色效果最好的2种营养源分别是酵母粉、蛋白胨，18 h脱色率分别可达到91.9%、88.1%，可能是由于这2种营养源均是复杂的有机含氮化合物，既能提供碳源又能提供氮源；无机氮源尿素作为营养源时，菌株的脱色效果很低，只有34%左右；牛肉膏、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉这4种营养源，也有较好的脱色效果。在后续的试验中，选取酵母粉作为颜料脱色菌株ZW4生长的营养源。

2.6酵母粉浓度对菌株ZW4脱色效果的影响

在含颜料的好氧培养基中设置0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%、1.5%、2.0%共7个酵母粉浓度。由图7可见，颜料脱色率随酵母粉浓度升高先呈增加趋势，酵母粉浓度从0.1%增大到1.0%时，菌株培养18 h对染料的脱色率从58.9%增至90.9%；酵母粉浓度从1.0%增至2.0%时，颜料脱色率没有明显差异，约为90%。利用微生物处理染料废水，过多的外加营养源会增加水体的COD及氨氮，造成水体二次污染，因此在对脱色率影响不大的情况下，应选择低浓度的营养源，故菌株脱色颜料的最适酵母粉浓度为1.0%。

2.7接种量对菌株ZW4脱色效果的影响

在颜料脱色培养基中设置1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%、12%共9个接种量。由图8可见，菌株ZW4接种量为5%时，脱色率达到87.8%；接种量从5%增至10%时，脱色率有所升高，但升幅并不大；接种量继续增大，脱色率反而有所下降，可能是由于过大的接种量导致细菌之间发生营养、空间竞争性抑制作用；而接种量小于3%时，可能由于菌量较少，菌体生长较慢，脱色率低于70%。从成本和微生物生长繁殖等角度考虑，确定5%接种量为最适接种量。

2.8温度对菌株ZW4脱色效果的影响

设置10、15、20、25、30、35、40、45、50℃共9个温度梯度考察温度對脱色效果的影响。由图9可见，10、50℃时，菌株ZW4的脱色效果相对较差，18 h时脱色率分别为56.3%、56.5%，此时菌液D_600nm很低，这说明过低或过高的温度抑制了菌株生长，从而降低了菌株的脱色性能；菌株在20～35℃范围内具有较好的脱色能力，18 h时脱色率达到85%左右；脱色最佳温度为35℃，脱色率最高，可达到87.3%。这是由于随着温度的升高，偶氮染料的酶促反应速率和菌体的生长速率加快，导致脱色效果提升，当温度增长过高，可能会引起菌体的重要组成成分如蛋白质、核酸和酶等对温度敏感的物质发生不同程度破坏，从而影响菌株的脱色能力。因此，选择35℃为试验最合适的温度。

2.9 pH值对菌株ZW4脱色效果的影响

pH值是菌株生长和偶氮染料降解的一个重要参数，通过影响细胞质膜的通透性和结构来影响菌株的生长速率，对酶活性也有一定影响，一般偶氮染料脱色合适的pH值范围在6.0～10.0之间，本试验将脱色培养基的pH值调为3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5、9.5共8个梯度。由图10可见，pH值为3.5、4.5时，颜料的脱色率低于70%，此时菌株的D_600nm分别只有0.254、O.347，这说明过酸条件下，菌株生长受到抑制，从而影响脱色效果；pH值在5.5～9.5范围，菌株均有很好的脱色能力，其中以pH值为7.5时脱色率最高，菌株培养18 h对颜料的脱色率达到88.5%。

2.10盐度对菌株ZW4脱色效果的影响

在酵母粉1.0%、接种量5%、温度35℃、pH值为7.5条件下，设置10个盐度梯度以研究盐度对菌株颜料脱色性能的影响。由图11可见，盐度小于2.0%时，染料的脱色率约为90%，低浓度的盐溶液对菌株脱色能力没有明显影响，盐度为0%、0.5%、1.0%、2.0%時菌体D_600nm分别为1.233、1.240、1.234、1.212；盐度为2.0%～15.0%，颜料的脱色率不断降低，菌株活性随盐度升高受到抑制，盐度高达10%、12%、15%时，48 h时菌株的脱色率分别仅为66.5%、58.2%、49.1%，此时菌体浓度很低。因此，盐度应小于2%。

2.11颜料初始浓度对菌株ZW4脱色的影响

设置50、100、150、200、300、400、500 mg/L共7个颜料浓度梯度，以研究颜料初始浓度对菌株脱色性能的影响。由图12可见，随着颜料起始浓度的增加，相同时间段内，菌株的脱色率逐渐降低；颜料起始浓度为50、100、150 mg/L时，菌株的脱色率达到90%所需的时间分别为18、24、42 h。菌株的脱色率随颜料浓度的升高而降低，这可能是因为高浓度颜料对菌株有毒副作用，从而抑制菌株对颜料红23的脱色。

2.12颜料生物的脱色方式

微生物对偶氮染料的脱色机理一般可分为2大类，即吸附脱色和降解脱色。对脱色48 h的上清液进行200～700 nm紫外光谱扫描发现，随着反应的不断进行，染料特征吸收波长579 nm处的特征吸收明显降低，这说明菌株Proto-theca sp.能较为彻底地降解颜料红23；降解后菌液在388 nm左右处有新的吸收峰生成，这说明有新的物质产生，颜料的生物脱色方式主要是降解脱色（图13）。

2.13菌株脱色颜料红23前后的毒性试验

通过比较2、4、6、7、9 d这5 d的数据，发现9 d的数据有较好的规律。由表2可见，颜料红23脱色前后处理的小麦、菜豆种子，其生长情况有明显差异；与对照相比，颜料红23脱色前的溶液明显抑制小麦、菜豆种子胚芽和胚根的生长；经菌株ZW4脱色后的颜料溶液处理种子，其生长虽不及对照，但较脱色前已有明显改善，这可以说明颜料红23经菌株脱色后的毒性有明显降低。

3结论与讨论

Kodam等在好氧条件下，筛选出能快速生长、脱色范围广且对染料降解彻底的好氧细菌。。目前，国内外尚未有颜料生物脱色方式的报道，能以降解物质为唯一碳源的报道也很少。本试验发现的菌株ZW4不能以颜料红23作为唯一碳源生存；通过紫外-可见分光光度计测定发现，脱色后的颜料红23废水生成新的物质，至于是何种物质还有待进一步研究。偶氮染料生物处理技术作为一种经济、环境友好型的方法，在处理工业废水、印染废水方面已得到广泛应用，但受到环境污染影响，实际应用降解菌时常会发生降解菌总量减少、从自然界筛选到的降解菌降解酶活性普遍较低等问题。谢学辉等认为，混合菌群往往对试验废水具有更好的脱色率。本试验筛选出4株具有较好脱色能力的菌株，仅对优势菌株ZW4对颜料红23废水的脱色能力进行研究，后续可以考虑选择最佳的混合菌群以进行颜料废水脱色研究。

总之，通过本试验获得结论主要有：从活性污泥中筛选出1株能高效脱色颜料红23的菌株ZW4，经16S rRNA基因序列鉴定，该菌株与其他菌株同源性不高，有可能为1个新的菌种，结合菌株形态学特征，暂将该菌株命名为原壁菌（Prototh-eca sp.）；菌株ZW4脱色颜料的最佳营养源是酵母粉，最适宜条件为酵母粉浓度1.0%、接种量5%、pH值7.5、温度35℃，菌株耐盐性能良好，在高达8%盐浓度下对颜料有较好的脱色效果；紫外-可见分光光度计扫描脱色代谢产物的吸收图谱发现，菌株ZW4对颜料脱色过程主要以生物降解为主；毒性试验表明，脱色后的颜料红23对植物的毒性下降。