柴明艳

摘要：从车前草叶中分离内生真菌，进行发酵培养，采用其发酵液开展体外抑菌试验，观察其对4种指示菌的抑制作用，与常规抗生素效果进行对比，并进一步探讨该发酵液对指示菌的最低抑菌浓度。结果发现，从车前草叶中分离出19株内生真菌，其中菌株Y₁₁对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均表现出较强的抑菌作用，其效果与杆菌肽相近；菌株Y₁₁对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的最低抑菌浓度分别为0.125、0.250、0.031、1.000 g/L。由结果可知，车前草叶内存在具有抑菌活性的内生真菌，可作为筛选抑菌活性物质的新资源。

关键词：车前草；内生真菌；分离；抑菌活性

中图分类号：Q939.9 文献標志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0353—04

植物内生菌（Endophyte）是指在一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织器官或细胞间隙内的细菌、真菌或放线菌。研究证实，内生菌和宿主问的生态关系密切，发挥着多种生物学功能。有些内生菌对植物病原菌具有拮抗作用，可保护植物免受病害侵袭；有些内生菌可使宿主体内形成某些次生代谢产物；有些内生菌能产生与宿主相同或类似的生理活性成分；还有些内生菌只是与宿主具有共生或伴生关系，其生物学作用尚未被揭示。目前从植物内生菌中已分离到较多的生防菌种，但有关车前草内生菌资源的研究却未见报道。车前草作为我国传统中药，别称车轮菜，是车前科植物车前（Plantago asiatica L.）或平车前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有清热、利尿、通淋、凉血、祛痰、解毒等药理功效，可用于痰热咳嗽、吐血衄血、热淋涩痛、水肿尿少、暑湿泄泻、痈肿疮毒等疾病治疗。迄今，关于车前草品种资源、种植技术、活性成分及其生物学功能等方面已有较多报道，却无关于其内生菌相关的研究报道。本研究从车前草叶中分离内生真菌，并测定其对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等4种指示菌的抑菌活性，旨在筛选出具有抑菌活性的车前草内生菌，再筛选出具有明显抑菌效果的菌株，优化其发酵条件，为进一步发掘抑菌活性物质并开发利用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试植物 分离内生菌所用材料为无病虫害、生长旺盛的车前草叶片组织，采自山东省淄博职业学院郊外。

1.1.2指示菌 指示菌为金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌，由淄博职业学院制药与生物工程系实验室提供。

1.1.3培养基 内生真菌分离和纯化采用PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水补足体积至1 L，pH值7.2～7.4；指示菌生长采用营养琼脂培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水补足体积至1 L，pH值自然；液体发酵采用PD培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水补足体积至1 L，pH值为7.2～7.6。以上各种培养基均在0.1 MPa、121℃条件下高温灭菌30 min后备用。

1.1.4药敏试纸 药敏试纸购自北京赛为思生物技术开发中心，氯霉素药敏试验纸片浓度30μg/片，强力霉素药敏试验纸片浓度30μg/片，杆菌肽药敏试验纸片浓度10μg/片，青霉素药敏试验纸片浓度10μg/片，庆大霉素药敏试验纸片浓度10μg/片。

1.2试验方法

1.2.1内生菌分离与纯化 内生真菌分离参照组织块点植法进行。取新鲜车前草的叶片组织，用自来水洗净，消毒纸吸干，75%乙醇溶液浸洗15～30 s，无菌水反复冲洗后吸干，0.1%氯化汞漂洗1～2 min，无菌水冲洗吸干。将消毒后的叶片切成0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，种植于加有30 mg/L链霉素的PDA平板上，每平皿接种3块，于28℃下静置避光培养，待叶片组织边缘长出菌丝后，用接种针挑取少许边缘菌丝接种到新的PDA培养基上，反复纯化至单一培养菌株，置于4℃冰箱保存待用，分别将菌种编号为Y₁、Y₂、…、Y_n。

为检测试验材料表面是否彻底消毒，取以上最后1次冲洗液涂布于PDA培养基平板上，于同等条件下培养作为对照，如对照平板无菌丝长出即表明消毒彻底，后续试验所分离到的真菌来自叶片内部。

1.2.2内生真菌发酵液的制备 在内生真菌纯化用的PDA培养基上，用0.4 cm打孔器在平板上各打取6块菌饼，接种于装有PD培养基的100 mL摇瓶中，静置1 d后，于28℃、180 r/min恒温培养5 d，制备成单个内生真菌的发酵产物。将摇瓶取下静置后，取上层清液于3 500 r/min离心10 min，取上层清液于4℃保存备用。

1.2.3配制1×10⁶CFU/mL的指示菌悬液 用接种环取少许指示菌分别接于等量PD营养培养基中，置于37℃下活化培养1 d。依据微量稀释法将活化后的指示菌配成1×106CFU/mL悬液，作为内生真菌抑菌作用的后续研究材料。指示菌包括金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌。

1.2.4内生真菌发酵液抑菌活性 采用滤纸扩散法测定内生真菌的抑菌活性。在无菌条件下，取1×10⁶ CFU/mL的指示菌悬液100μL，均匀涂布于营养琼脂培养基上，将吸有真菌发酵液、直径6 mm的无菌滤纸圆片置于培养基中，每种发酵液重复3次，以无菌水为对照，同时以氯霉素、青霉素、杆菌肽、强力霉素、庆大霉素等药敏试纸作抑菌效果对比，37℃培养7～8 h后，用游标卡尺采用十字交叉法测其抑菌圈直径，取其平均值作为该菌株发酵产物的抑菌直径。各样品抑菌效果的判定标准为：抑菌圈直径>15 mm为高度敏感，抑菌圈直径10～15 mm为中度敏感，抑菌圈直径7～9 mm为低度敏感，无抑菌圈者为不敏感。

1.2.5最强抑菌活性菌代谢产物的抑菌作用 无菌条件下，取100μL指示菌悬液均匀涂布于LB培养板上，35 min后将浸泡最强抑菌活性菌发酵液（2 h）、直径6 mm的无菌滤纸片圆片，贴附到指示菌平板上，同时做氯霉素、强力霉素、杆菌肽、庆大霉素、青霉素等药敏试纸的对比试验，每个处理重复3次，37℃培养1 d，观察各培养板指示菌的生长状况及抑菌圈大小，测定各处理抑菌圈直径，即为相应样品抑菌圈值。

1.2.6最低抑菌浓度（MIC） 将最强抑菌活性菌发酵液蒸发浓缩干燥，配制成一定质量浓度，采用琼脂二倍稀释法、滤纸圆片扩散法，设置3组平行试验，各设8个梯度，测定车前草内生真菌发酵液对大肠杆菌的MIC值。

1.3数据处理

采用SPSS 17.0统计软件分析试验数据。

2结果与分析

2.1内生真菌发酵液抑菌作用

从车前草叶中分离到具有抑菌活性的内生真菌共14株，其中至少对1种指示菌具有中等抑菌作用（抑菌直径>10 mm）的有11株；至少对1种指示菌具有高抑菌活性（抑菌直径>15 mm）的内生真菌有8株，占总分离菌株数量的42%；另有5株内生真菌对各指示菌均无抑制作用（表1）。

2.2内生真菌抑菌效果

由表2可见，所分离到的车前草内生真菌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，共有12株内生真菌对其有抑菌活性，占总分离菌株数量的63%；对粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有抑菌活性的菌株分别占总分离菌株数量的47%、58%、37%。总的来说，分离到的内生菌对指示菌的抑菌活性有差异，具有一定的特异性。

在具有抑菌活性的14株内生真菌中，以Y₁₁的效果最好，在对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌抑菌试验中的抑菌圈直径>15 mm，并表现出一定的广谱特性，可见该菌株抑菌作用显著，具有很高的研究价值和应用前景。因此，以Y₁₁为车前草高抑菌活性内生真菌，进行该菌株与常用抗生素的对比研究，并进一步探讨其最低抑菌浓度。

2.3 Y9发酵液与抗生素抑菌活性对比

如表3所示，与几种常用抗生素相比，车前草内生真菌Y₁₁发酵液对4种指示菌均有较好的抑菌作用。Y₁₁发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与强力霉素、杆菌肽接近，显著弱于青霉素（P<0.05），显著强于氯霉素（P<0.05）；对粪链球菌的抑制作用也相对较强，与对照抗生素抑菌效果接近；对大肠杆菌的抑菌圈大于青霉素、庆大霉素，却小于氯霉素、强力霉素、杆菌肽；对沙门氏菌的抑菌圈只是略大于氯霉素。可见，Y₁₁发酵液具有较强的抑菌效果，且广谱性较好，但特异性不如部分供试抗生素。

2.4对大肠杆菌的最低抑菌浓度

从表4可见，将Y₁₁发酵液浓缩干燥后，其对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的最低抑菌浓度分别为0.125、0.250、0.031、1.000 g/L，反映出车前草最强抑菌株的抑菌特性。

3讨论

3.1车前草内生真菌的分离结果

现有研究证实，植物内生真菌遍存在于各种植物体内，可作为微生物资源进行应用开发，成为新型生物医药。其原因是内生真菌能与宿主植物形成特殊生境心，二者均具备类似代谢物的合成途径，即可产生宿主植物所富集的生物活性物质。车前草所含生物活性物质抑菌功能显著，具有重要的医药价值，目前却无相关内生真菌的研究。现代生物学中，体外抑菌试验常被作为抑菌研究的主要方法，能准确地揭示供试品的抑菌效果，不受内环境各因素的干扰，且具有重复性好的特点。因此，要研究车前草内生真菌的抑菌作用，可先分离纯化出内生真菌，再进行发酵液体外抑菌试验。

本试验对车前草内生真菌进行分离纯化，共获取19株活菌，并全部进行发酵，获取代谢产物进行抑菌试验，筛选出1株Y₁₁菌株，具有最强抑菌作用。车前草内生真菌的获取受到生境、品种、分离、纯化等因素的影响，个样研究已揭示其代表性，但有關车前草内生真菌的分离研究还有待进一步探讨。

3.2车前草内生真菌的抑菌作用

内生真菌可脱离宿主植物独立生长，在适宜生境中能通过发酵获得大量目的活性产物，依据该特性可获取新源天然药物，以缓解某些药用植物资源短缺、生长周期长、生态系统损害等现象，并能为新药开发与濒危药用植物保护等难题提供重要思路。研究证实，车前草体内能合成多种活性物质，并具有广谱抗菌效果，可能与其共生的内生真菌有关。

一直以来，抗生素在人与动物疾病防治中发挥着巨大功能，但由于病原菌耐药性增加、药物残留等问题的日益凸显，使得寻求天然、高效、绿色的替代品更加重要。本研究从车前草叶片内共分离到19株内生真菌，其中8株发酵液至少对1种指示菌具有较强的抑菌效果，而其他不具有抑菌活性的内生真菌极可能是由于所取组织部位处在代谢休眠期，也可能因培养条件不适等。可见，内生真菌合成抑菌活性物质还受到外界环境温度、pH值以及培养时间等因素的影响，有待深入研究。后续研究证实，Y₁₁发酵液对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌均表现出较强的抑制作用，尤其是对前三者具有很好的抑菌效果，可与部分抗生素相媲美，且具有较低的最低抑菌浓度，预示Y₁₁菌株具有非常高的开发价值，极可能取代部分抗生素进行应用。

3.3结论

本研究从车前草内生真菌中筛选出Y₁₁菌种，其代谢活性产物对金黄葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等指示菌均表现出很好的抑菌作用，且效果与部分常用抗生素相近，具有良好的应用价值。因此，下一步有必要研究车前草内生真菌活性产物的抑菌成分、理化特性、作用机制以及活菌株培养时间、pH值、温度、营养素构成等条件优化，为车前草抗菌活性物开发利用提供依据。